Kan metileenblou mitochondriale Kompleks III omseil? Waarom studies verskil

Twee laboratoriums het gevra of metileenblou 'n geblokkeerde mitochondriale Kompleks III kan omseil. Die een het nee geantwoord. Die ander het ja geantwoord. Albei het data gehad.

Die eerste studie, met mitochondria uit muisbreine, het bevind dat die kleurstof dit nie kan doen nie. Die tweede, met breinmitochondria van drie knaagdierspesies, het bevind dat dit gedeeltelik kan. 'n Derde studie, met muislewer, word dikwels saam hiermee aangehaal, maar het iets anders getoets. Hou dit in sy regte konteks en die helfte van die verwarring verdwyn.

Daar is geen universele meganisme om aan te kondig nie. Daar is drie eksperimente met verskillende blokkeerders, dosisse en meetuitkomste. Lees eers die toestande. Die gevolgtrekkings volg daaruit.

Wat omseiling hier beteken

Elektrone betree die ketting deur Kompleks I (vanaf NADH) of Kompleks II (vanaf suksinaat), beweeg deur Kompleks III na sitokroom c, en dan deur Kompleks IV na suurstof. Die gradiënt wat langs die pad opgebou word, is wat die sel benut om ATP te maak.

'n Bewering van omseiling beteken dat metileenblou elektrone stroomop van 'n blokkade opneem en hulle stroomaf afgee. Die geoksideerde kleurstof neem elektrone van NADH of vroeë kettingkomponente op en word leukometileenblou; die gereduseerde vorm gee hulle aan sitokroom c of terug aan die ketting. As die oordrag stroomaf van die blokkade plaasvind, herstel respirasie en membraanpotensiaal gedeeltelik. As dit by of stroomop van die blokkade plaasvind, herstel niks nie.

Een besonderheid van Kompleks III bepaal baie van hierdie dispuut. Die kompleks gebruik 'n Q-siklus met twee inhibeerderbindingsplekke. Antimisien bind aan die Qi-plek. Miksotiasool bind aan die Qo-plek. 'n Studie wat slegs een van hulle gebruik, het slegs die helfte van die kompleks getoets.

Studie een: geen omseiling in muisbreinmitochondria nie

Gureev en kollegas het mitochondria uit die korteks van C57BL/6-muise gebruik, met digitonien geïsoleer en by 0.1 mg proteïen per ml getoets. Die substrate het drie toestande gedek: piruvaat plus malaat teen 5 mM elk, suksinaat teen 10 mM met glutamaat teen 2 mM, en L-prolien teen 10 mM. Die blokkeerders was rotenoon teen 1 micromolar (Kompleks I) en antimisien teen 1 microgram per ml (Kompleks III). Kleurstofdosisse was 0.5, 1 en 2 micromolar, met 1 micromolar as die hoofkonsentrasie. Metodes en meetkurwes is in die FEBS Letters-mededeling.

Omseiling van Kompleks I het gewerk. Rotenoon het ADP-gestimuleerde respirasie van ongeveer 121 tot ongeveer 2 nmol per minuut per mg verlaag, en 1 micromolar kleurstof het dit tot ongeveer 21 herstel. Membraanpotensiaal het op piruvaat plus malaat en op L-prolien herstel.

Omseiling van Kompleks III het nie gewerk nie. Antimisien het respirasie tot ongeveer 16 verlaag, en die kleurstof het dit slegs tot ongeveer 20 verhoog. Membraanpotensiaal het op geen substraat herstel nie, selfs by kleurstofdosisse tot 5 micromolar. Peroksieddata het in dieselfde rigting gewys: kleurstof alleen het peroksiedvrystelling van 'n basale tempo van nagenoeg 76 pmol per minuut per mg tot ongeveer 1170, 1460 en 1945 by die drie dosisse verhoog, maar antimisien het daardie kleurstofgedrewe sein met onderskeidelik ongeveer 25, 88 en 96 persent verminder. As gereduseerde kleurstof direk met suurstof reageer, behoort die blokkering van Kompleks III nie die sein te onderdruk nie. Die outeurs het afgelei dat die gereduseerde kleurstof by die Qo-plek van Kompleks III geoksideer word, stroomop van die antimisienblokkade. Die kort lus, in woorde: skenkers na kleurstof, kleurstof na Qo, die normale roete verder. Rotenoon word omseil. Antimisien nie.

Studie twee: gedeeltelike omseiling in drie spesies, by albei inhibeerderbindingsplekke

Svab en kollegas het die ontwerp uitgebrei. Breinmitochondria van muise, rotte en marmotte is met Percoll geïsoleer en by dieselfde 0.1 mg per ml getoets, op piruvaat plus malaat of glutamaat plus malaat teen 5 mM elk. Hulle het twee Kompleks III-blokkeerders gebruik: antimisien A teen 0.3 micromolar en miksotiasool teen 1 micromolar. Die kleurstof was 2 micromolar in die meeste toetse en 0.5 in die sitokroom c-werk. Al drie spesies, met ooreenstemmende protokolle, verskyn in die ooptoegangartikel.

Albei blokkades is gedeeltelik omseil, in al drie spesies. In muismitochondria het antimisien respirasie onderdruk en die kleurstof het dit met ongeveer 60 persent verhoog, van ongeveer 37 tot 59 nmol per minuut per mg. Miksotiasool het dit met 88 persent onderdruk, tot ongeveer 4.5, en die kleurstof het dit vyfvoudig tot ongeveer 23 verhoog. Membraanpotensiaal het onder albei inhibeerders gedeeltelik gerepolariseer; dit is met twee kleurstowwe (safranien O en ratiometriese TMRM) gemeet om optiese artefakte uit te sluit.

Hierdie artikel het ook die oordrag direk getoets, wat die eerste studie nooit gedoen het nie. Eksogene geasetileerde sitokroom c teen 25 micromolar is nie deur mitochondria in 'n energietoestand gereduseer nie, met of sonder inhibeerders, maar die toevoeging van kleurstof het reduksie in albei gevalle aangedryf. In selvrye buffer het NADH plus kleurstof sitokroom c gereduseer teen 'n tempo wat eweredig aan NADH was. Die langer sprong, in woorde: reduksie-ekwivalente na kleurstof, kleurstof direk na sitokroom c, Kompleks IV na suurstof. Daardie roete slaan Kompleks III heeltemal oor, dus kan albei blokkeerders omseil word.

Twee bykomende meetuitkomste ondersteun dié interpretasie. NAD(P)H-fluoressensie het afgeneem toe kleurstof by miksotiasoolbehandelde mitochondria gevoeg is, wat beteken dat reduksie-ekwivalente deur die nuwe roete weggevloei het. Kleurstofabsorbansie by 660 nm het elke toevoeging op sy beurt gevolg, terwyl gesentrifugeerde supernatante getoon het dat geoksideerde kleurstof meer as honderdvoudig binne mitochondria in 'n energietoestand gekonsentreer het en dit daarna verlaat het toe die potensiaal ineengestort het. Die protonbalans pas ook: die oorslaan van die pompstappe laat ongeveer 2 protone per elektronpaar in plaas van 10 oor. Vinniger suurstofverbruik met slegs gedeeltelike repolarisasie is dus hoe 'n werklike omseiling lyk, nie getuienis daarteen nie.

Dieselfde preparaat het reaksies opgelewer wat oppervlakkige leeswerk afstraf. Met inhibeerder plus kleurstof het ADP respirasie verlaag in plaas van dit te verhoog, en vervoerblokkering het dit gestimuleer in plaas van vertraag, terwyl membraanpotensiaal steeds in die normale rigtings verander het. Suurstofverbruik alleen is misleidend in hierdie stelsel.

Studie drie: die lewerstudie wat Komplekse I en II getoets het, nie III nie

Lee en Boelsterli het muislewermitochondria en gekweekte hepatosiete gebruik wat deur efavirenz (Kompleks I, IC50 naby 30 micromolar) en hidrasien, die metaboliet van isoniasied (Kompleks II, IC50 naby 30 micromolar), beskadig is. Kleurstof teen ongeveer 30 micromolar het NADH-oksidasie, membraanpotensiaal en ATP herstel, terwyl dit oksidante en nekrotiese seldood verminder het. Die Redox Biology-artikel modelleer dit as kleurstof wat elektrone om die beskadigde Komplekse I en II heen dra.

Daardie resultaat is bevestigde stroomop-konteks, en dit sê niks oor Kompleks III nie, omdat niks in dié studie daar geblokkeer is nie. Dit kan nie een van die breinstudies bevestig of weerlê nie.

Die toestandsmatriks

Vier redes waarom albei Kompleks III-studies oor hul eie opstelling reg kan wees

1. Die blokkeerder was nie dieselfde ingreep nie. Antimisien alleen teen 1 microgram per ml teenoor antimisien teen 0.3 micromolar plus 'n afsonderlike Qo-plekblokkeerder. 'n Kleurstofroete wat die Qo-plek voed, misluk presies waar 'n direkte roete na sitokroom c slaag. Een plek kan nie albei verteenwoordig nie.

2. Die kleurstofdosis en tydsberekening het verskil. Hoofkonsentrasies van 1 teenoor 2 micromolar, vir 'n redokssiklusvormer waarvan die opname en direkte reduksie van sitokroom c konsentrasie- en tydafhanklik is. Klein dosisverskille plus verskillende meettye kan verskillende dele van dieselfde netwerk blootlê.

3. Die preparate het verskil. Isolasie met digitonien teenoor isolasie met 'n Percoll-gradiënt selekteer oorvleuelende, maar nie identiese, mitochondriale populasies nie. Die proteïenkonsentrasie was dieselfde, 0.1 mg per ml, dus val dié veranderlike weg, maar subpopulasie en integriteit nie. En die vermoede oor spesieverskille is uitgeskakel: die tweede groep het sy fenotipe ook in muise gereproduseer.

4. Die substraattoestand bepaal wat die kleurstof kan doen. Drie substraattoestande teenoor NADH-gekoppelde pare. NADH-beskikbaarheid en membraanpotensiaal bepaal gesamentlik hoe vinnig die kleurstof gereduseer word en waar dit versprei. 'n Roete wat gereduseerde kleurstof langs geoksideerde sitokroom c benodig, is van daardie keuse afhanklik.

Hoe om die volgende bewering van omseiling te lees

Vra watter kompleks geblokkeer is, met watter inhibeerder, by watter plek en dosis. Vra wat die kleurstofkonsentrasie was en wanneer die meting gedoen is. Vra na die weefsel, spesie, isolasie, proteïenkonsentrasie en substraat. En vra of potensiaal, respirasie, redokstoestand en 'n direkte oordragtoets ooreenstem, want suurstofverbruik alleen het hier meer as een keer in die verkeerde rigting gewys.

Die beperkte opsomming bly geldig. Daar is ooreenstemming oor kleurstofomseiling van Kompleks I. By Kompleks III toon muismitochondria met antimisien teen 1 microgram per ml en kleurstof teen 1 micromolar geen funksionele omseiling nie, terwyl drie spesies met antimisien teen 0.3 micromolar of miksotiasool teen 1 micromolar en kleurstof teen 2 micromolar gedeeltelike omseiling toon, met direkte oordrag van kleurstof na sitokroom c. Daardie stellings kan albei waar wees. Enigiets breër is ekstrapolasie.

Verwante leesstof plaas die betwiste bewering binne onbetwiste chemie: hoe metileenblou elektrone verplaas vir die oordragketting, die eksperimente oor omseiling van Kompleks I vir die bevestigde stroomop-geval, membraanpotensiaalmetings en hul artefakte vir waarom twee kleurstowwe nodig was, en laboratoriumhantering van redokssiklusvormers vir die slaggate van dosering en tydsberekening.