Waarom metileenblou se absorpsie met konsentrasie verander

Neem een bottel metileenblou-voorraadoplossing en skink twee glase. Vul die eerste met die voorraadoplossing en die tweede met 'n tienvoudige verdunning. Die tweede glas is ligter, soos verwag. Kyk mooi, en iets anders het ook verander. Die kleurskakering het verskuif. Die een oplossing neig na 'n helder hemelblou en die ander na 'n blou met 'n violetskynsel. Verdunning het meer gedoen as om die intensiteit te verminder. Dit het verander watter chemiese spesie die meeste absorbeer.

Die beginsel agter die verskuiwing is eenvoudig. Opgeloste metileenblou is nie net een spesie nie. Die enkele kleurstofkatioon, wat die monomeer genoem word, kan met sy vlak teen dié van 'n tweede katioon stapel om 'n dimeer te vorm, en dimere kan tot groter aggregate groei. Elke vorm het sy eie absorpsiespektrum. Wat 'n spektrofotometer rapporteer, is die som oor die mengsel wat in daardie kuvet, onder daardie toestande, teenwoordig is. Verander die mengsel en die spektrum verskuif, selfs wanneer die totale kleurstofinhoud 'n regstreekse verdunningsverhouding volg.

Monomere en dimere absorbeer verskillend

Stel jou die monomeer voor as 'n plat kaart met 'n positiewe lading wat oor sy ringstelsel versprei is. Twee sulke kaarte kan met hul vlakke teen mekaar lê. Die positiewe ladings stoot mekaar af, maar die plat aromatiese oppervlaktes trek mekaar deur stapelingsinteraksies aan, en omliggende water en teenione skerm die afstoting af. Die resultaat is 'n gebonde paar met gedeelde elektroniese toestande. Die toegelate oorgange daarvan lê by hoër energie as die monomeeroorgang, dus verskyn die dimeerband by 'n korter golflengte as die monomeerband, met groter aggregate wat verder na die blou kant as 'n skouer bydra.

By baie lae konsentrasie in skoon water oorheers monomere en die langgolflengteband. Namate die totale konsentrasie styg, neem die gepaarde vorm 'n groter aandeel in en groei die kortgolflengteband relatief tot die eerste. Die verhouding tussen die twee bande dui dus die samestelling van die mengsel aan, nie die totale konsentrasie direk nie. 'n Lesing by 'n enkele golflengte kan die twee nie onderskei sonder 'n aanname oor watter vorm teenwoordig is nie.

Dit is waarom verwysingspektra altyd saam met hul toestande aangegee moet word. Die spektrale verwysing vir metileenblou gee bandposisies in tabelvorm aan saam met die oplosmiddel, soutagtergrond, pH, temperatuur en konsentrasiebereik wat dit opgelewer het. Haal 'n piek aan sonder daardie toestande, en die getal is onvoldoende omskryf. Twee laboratoriums kan albei korrek wees oor verskillende spektra van dieselfde kleurstof omdat hulle verskillende mengsels gemeet het.

Wat die ewewig verskuif

Konsentrasie is die belangrikste beheerfaktor. Dimeervorming vereis dat twee monomere ontmoet, dus styg die aandeel daarvan vinniger as lineêr met die totale kleurstofkonsentrasie. Gerapporteerde dimerisasiekonstantes in waterige oplossings lê naby kamertemperatuur in die duisende per molar, dus styg die dimeeraandeel skerp deur die micromolar-bereik. 'n Breë globale passing wat kleurstofkonsentrasies van micromolar tot millimolar dek, het reeds onder 34 micromolar 'n tetrameerbydrae groter as nul gevind. Dit waarsku teen vertroue in 'n streng tweespesiepassing by tientalle micromolar. Presiese fraksies hang van die medium af, en daarom gee hierdie artikel tendense eerder as 'n universele omskakelingstabel.

Sout is die tweede beheerfaktor. Opgeloste ione skerm die afstoting tussen twee katione af, dus verskuif bygevoegde natriumchloried en soortgelyke elektroliete die mengsel na dimere en aggregate by dieselfde kleurstofkonsentrasie. Hierdie effek is sigbaar in studies van metileenblou-aggregasie in soutoplossings en waterige media, waar kleurstof van ongeveer 1 micromolar tot 3.4 millimolar oor 0 tot 0.15 molar natriumchloried gemeet is. In daardie passing het die tetrameerfraksie ongeveer 0.93 bereik by die kombinasie van hoë kleurstof- en hoë soutkonsentrasie. 'n Spektrum wat in water aangeteken is en een wat in fisiologiese soutoplossing aangeteken is, is dus nie uitruilbare standaarde nie.

Temperatuur werk in die teenoorgestelde rigting. Stapeling stel gebonde water vry en word deur termiese beweging teengewerk, dus laat die verwarming van 'n oplossing gewoonlik sommige dimere weer in monomere dissosieer, terwyl verkoeling assosiasie bevorder. Die gepaste dissosiasie-entalpie is negatief, ongeveer minus 30 kilojoules per mole oor 282 tot 333 kelvin, wat eksotermiese assosiasie bevestig. 'n Koue monster wat onmiddellik ná verkoeling gemeet word, kan meer geaggregeerd lyk as dieselfde monster wat ná ewewigsinstelling by kamertemperatuur gemeet word.

Die oplosmiddel bepaal die uitgangspunt. Water, met sy sterk hidrofobiese effek, bevorder stapeling van plat kleurstofkatione. Alkohole soos etanol en metanol solvateer die ringe beter en breek aggregate op, dus lyk dieselfde kleurstofkonsentrasie meer monomeries in etanol as in water. Aprotiese mede-oplosmiddels doen dieselfde: in mengsels van water en DMSO by 293 kelvin het bygevoegde DMSO dimerisasie onderdruk, wat daarop dui dat waterstruktuur stapeling aandryf. Oppervlakaktiewe stowwe verg versigtigheid in albei rigtings. Bo hul kritieke miselkonsentrasie kan miselle monomere individueel solubiliseer en 'n monomeeragtige spektrum herstel. Onder daardie punt kan 'n teenoorgesteld gelaaide oppervlakaktiewe stof eerder stapeling bevorder: by 100 micromolar kleurstof het SDS-gedrewe polimerisasie naby 4 millimolar SDS, ongeveer die helfte van die miselpunt, 'n hoogtepunt bereik, voordat herverdeling by hoër vlakke van die oppervlakaktiewe stof plaasgevind het. Werk oor die uitwerking van kleurstof-oplosmiddelinteraksies en georganiseerde media op metileenblou-spektra illustreer hoe sterk die onmiddellike molekulêre omgewing, nie net die konsentrasie in die oplossing as geheel nie, die waargenome bande bepaal.

pH is hoofsaaklik by die uiterstes belangrik. Oor die byna neutrale bereik wat in die meeste laboratoriumwerk gebruik word, bly metileenblou in sy bekende kationiese blou vorm, en aggregasie oorheers die spektrale gedrag. Sterk suur of basis, redokschemie wat die kleurlose leukovorm produseer, of binding aan proteïene en deeltjies voeg elk toestande by wat verder as die monomeer-dimeerpaar strek. Wanneer 'n spektrum verander nadat 'n buffer bygevoeg is, ondersoek die buffersamestelling vir sout en bindende komponente voordat alles aan pH alleen toegeskryf word. Die verwysing oor chemie en protonering hou hierdie identiteitsvrae apart van die aggregasievraag wat hier behandel word.

Waarom die Beer-Lambert-reguitlyn buig

Die Beer-Lambert-verband bepaal dat absorbans gelyk is aan absorptiwiteit maal konsentrasie maal padlengte. Dit is 'n telwet. Dit neem aan dat die voorwerpe wat getel word, identies bly namate hul getal verander: een absorberende spesie, 'n vaste spektrum, geen chemiese verandering met konsentrasie nie, monochromatiese meetlig, geen verstrooiing of heruitstraling nie, en lig wat werklik die aangegewe pad aflê.

Aggregasie verbreek die eerste aanname. Formeel bly totale absorbans 'n som oor spesies: padlengte maal elke absorptiwiteit maal die konsentrasie van die betrokke spesie. Elke spesie gehoorsaam die wet. Die mengsel doen dit nie, omdat die spesiekonsentrasies nie-lineêre funksies van die totale kleurstofkonsentrasie is. 'n Kalibrasiekromme van absorbans by die monomeerband teenoor totale kleurstof begin dus reguit in die limiet van sterk verdunning en buig afwaarts namate konsentrasie styg, omdat elke bykomende toename verhoudingsgewys minder monomeer bybring. 'n Kromme wat by die dimeerband gelees word, buig in die teenoorgestelde rigting. Aggregasienavorsing identifiseer presies hierdie meganisme as die oorsaak van die waargenome Lambert-Beer-afwykings. Die algemene fout is om 'n reguitlyn deur die geboë gebied te pas en dit te ekstrapoleer. Die lyn is slegs geldig binne die bereik en matriks waarin dit opgestel is.

Verdunning skep 'n verwante slaggat. Verdunning van 'n gekonsentreerde voorraadoplossing om binne die instrument se bereik te kom, behou nie die spesieverhouding nie. Die verdunde oplossing in die kuvet stel opnuut ewewig in, met 'n verskuiwing na monomere, dus beskryf die spektrum die verdunde monster korrek maar die voorraadoplossing verkeerd. Terugberekening van die voorraadoplossing se spektrum deur absorbanswaardes opwaarts te skaal, herstel die skatting van die totale inhoud slegs indien die kalibrasie reeds vir die verskuiwing voorsiening maak. Dit herstel nooit die oorspronklike bandvorm nie. Enigiemand wat die spektrum van 'n konsentraat met 'n verdunde verwysing vergelyk, vergelyk twee verskillende mengsels.

Padlengte is deel van die resultaat

Absorbans skaal met die afstand wat lig deur die monster beweeg. 'n 10 mm-kuvet gee tien keer die absorbans van 'n 1 mm-kuvet wat dieselfde oplossing bevat. Daardie skaling is slegs vir dieselfde oplossing presies, en aggregasie maak hierdie voorbehoud deurslaggewend.

In die praktyk is padlengte 'n hulpmiddel om binne die geldige bereik te bly. 'n Lang pad bied sensitiwiteit vir verdunde, hoofsaaklik monomeriese oplossings. 'n Kort pad hou 'n gekonsentreerde monster binne die skaal sonder 'n groot verdunningstap wat die ewewig sou herstel. Die aggregasienavorsingsprogram agter die getalle hierbo het presies dit gedoen: selle van 1 centimeter vir 1.1 tot 34 micromolar kleurstof, en selle van 0.01 centimeter vir 94 micromolar tot 3.4 millimolar. Mikrovolume-meetplatforms en plaatlesers voeg hul eie geometrie by, met kort en soms veranderlike paaie, asook oppervlaktes waaraan kationiese kleurstof kan adsorbeer. Rapporteer die padlengte saam met die getal, net soos die spektrale verwysing oplosmiddel en sout rapporteer. 'n Absorbans sonder 'n padlengte is nie 'n resultaat nie. Dit is 'n gerug.

Meetdissipline volg uit die meganisme. Laat monsters by een temperatuur ewewig bereik voordat lesings geneem word. Gebruik dieselfde kuvettipe en -oriëntasie, ooreenstemmende blanko's met dieselfde sout- en bufferagtergrond, en skoon glasware, omdat metileenblou aan glas en plastiek adsorbeer en 'n gekleurde kuvet 'n oorblyfsel van die vorige gekonsentreerde monster behou. Neem lesings spoedig ná voorbereiding wanneer aggregasiekinetika belangrik is, en stel elke kalibrasiekromme op in dieselfde matriks en by dieselfde padlengte as die onbekende monsters. Onthou by visuele kontroles dat die oog 'n swak spektrometer is. Of oplossingskleur suiwerheid kan bepaal is 'n afsonderlike vraag met 'n negatiewe antwoord, en kleurskakeringsverskuiwings weens aggregasie is een rede daarvoor.

'n Diagram om langs die instrument te hou

Die figuur hieronder vat die artikel in een werkbankverwysing saam. Drie oplossings bevat dieselfde kleurstof, maar verskil in totale konsentrasie en soutagtergrond. Hul skematiese spektra toon hoe die langgolflengte-monomeerband aandeel aan die kortgolflengte-dimeerband afstaan namate stapeling toeneem. Toestande is op die figuur gedruk omdat die krommes nie daarsonder hergebruik kan word nie. Gebruik die spektrale verwysing vir gemete bandposisies onder aangegewe toestande. Vir hoe die kleurstof selle binnegaan sodra dit in oplossing is, sien selopname deur reduksie en verdeling. Vir hoe ligdosis en geometrie fotochemiese meetresultate verder beïnvloed, sien ligblootstelling en meetgeometrie.

Die kernreël het twee dele. Die spektrum identifiseer die mengsel wat onder die aangegewe toestande in die kuvet teenwoordig is. Slegs 'n kalibrasie wat onder daardie selfde toestande opgestel is, skakel 'n absorbans na 'n totale konsentrasie om.