Alternatiewe vir metileenblou vir mikroskopie: kies volgens taak

Vir 'n eenvoudige bakteriële smeer kan kristalviolet metileenblou vervang wanneer die doel is om selvorm te sien. Vir lewende selle kan fasekontras sonder enige kleuring die beter alternatief wees. Die keuse hang af van die waarneming wat jy moet maak.

Veronderstel twee mense ondersoek dieselfde bakteriële kultuur. Die een wil staafvormige selle van ronde selle onderskei. Die ander wil weet of 'n behandeling die bakterieë doodgemaak het. 'n Kleuring wat vir die eerste persoon 'n duidelike beeld gee, kan vir die tweede persoon geen bruikbare antwoord gee nie.

Voltooi hierdie sin voordat jy 'n plaasvervanger kies: “Ek moet ___ in ___ waarneem, en die selle moet / hoef nie lewend te bly nie.” Daardie sin bepaal die taak wat die kleuring moet verrig.

Begin met die monster en die vraag

Besluit eers of die selle lewend moet bly en identifiseer daarna die kenmerk wat jy moet waarneem:

• Selle moet lewend bly: oorweeg ongekleurde fasekontras of DIC vir beweging of vorm; oorweeg Hoechst 33342 met fluoressensie vir kern-DNS; kies vir membraanintegriteit 'n gevalideerde toets soos SYTO 9 met propidiumjodied.
• Selle hoef nie lewend te bly nie: oorweeg vir bakteriële morfologie 'n eenvoudige kristalvioletkleuring of negatiewe nigrosienkleuring; gebruik vir die Gram-reaksie die volledige Gram-kleuringsmetode; oorweeg DAPI-fluoressensie vir kern-DNS in gefikseerde selle. Gebruik hierdie tabel om die beperkings van elke vertakking te vergelyk. Dit is metodiekeuses, nie instruksies om bottels binne 'n bestaande protokol om te ruil nie.

Vervang die metode versigtig vir 'n eenvoudige smeer

Kristalviolet is 'n praktiese kandidaat wanneer die taak 'n enkelkleurbeeld van bakteriële morfologie is. Die FDA se Bacteriological Analytical Manual lys twee kristalvioletformulerings wat geskik is vir eenvoudige kleuring. Gebruik 'n gedokumenteerde formulering en die gepaardgaande voorbereidingsmetode; die naam van die kleurstof alleen spesifiseer nie 'n bruikbare reagens nie.

Kristalviolet word ook in Gram-kleuring gebruik, maar dit maak 'n eenvoudige kristalvioletkleuring nie 'n Gram-kleuring nie. In die ASM Gram-kleuringsprotokol hang die differensiële resultaat daarvan af dat kristalviolet, jodium, ontkleuring en teenkleuring opeenvolgend werk. As daardie stappe weggelaat word, verander dit wat die beeld kan aantoon. Sien eenvoudige kleuring teenoor Gram-kleuring vir dié onderskeid.

Nigrosien bied 'n ander manier om omlyne sigbaar te maak: dit verdonker die agtergrond terwyl die bakteriële selle betreklik lig bly. Daar is 'n nuttige besonderheid in Merck se nigrosieninstruksies wat 'n algemene lys van plaasvervangers kan miskyk. Die gespesifiseerde werksformulering bevat formaldehied. Jy kan dus nie uit die woorde “negatiewe kleuring” aflei dat dit met lewende selle versoenbaar is nie, selfs al lyk die selle self ongekleur. Kontroleer die volledige formulering en monsterpreparering.

Oorweeg vir lewende monsters om die optika te verander

As jy wil kyk hoe selle beweeg of verdeel, kan die toevoeging van nog 'n kleurstof die waarneming bemoeilik. Soos Nikon in sy gids oor kontras in deursigtige monsters verduidelik, maak fasekontras en differensiële interferensiekontras, of DIC, monsters sigbaar deur verskille in hul optiese eienskappe. Dit kan lewende, ongekleurde selle sigbaar maak, mits die mikroskoop die vereiste komponente het.

Hierdie keuse behou 'n ongekleurde preparaat, maar verander die beskikbare inligting. Jy kan 'n grens of beweging volg sonder om te weet watter molekule die kontras veroorsaak het. As molekulêre lokalisering die vraag is, kies eerder 'n geskikte merkmetode.

Vir kern-DNS onderskei Invitrogen se vergelyking van DAPI- en Hoechst-kleurstowwe tussen DAPI se algemene gebruik met gefikseerde selle en die meer seldeurlaatbare Hoechst 33342, wat vir die merk van lewende selle verkies word. Albei vereis fluoressensietoerusting. Nie een is 'n direkte plaasvervanger vir 'n gekleurde helderveldkleuring nie.

Behandel blootstelling aan kleurstof en beligting as eksperimentele toestande. Vergelyk gekleurde en ongekleurde preparate wanneer die gedrag van die selle jou meting is.

'n Rooi sel is nie outomaties 'n dooie sel nie

SYTO 9 en propidiumjodied word dikwels saam gebruik om bakteriële membraanintegriteit te beoordeel. Die BacLight-handleiding verbind ongeskonde membrane met groen kleuring en beskadigde membrane met rooi kleuring. Dié interpretasie moet vir die monster gevalideer word.

'n 2019-studie deur Rosenberg en kollegas illustreer die probleem. In 24-uur-E. coli-biofilms op glas in fosfaatgebufferde soutoplossing het ongeveer 96% van die selle in situ propidiumjodied-positief voorgekom. Tog het die outeurs geraam dat 82% ná versameling kweekbaar was. Konfokale beelde het selle met groen binneste gedeeltes onder rooigekleurde materiaal getoon, wat ekstrasellulêre nukleïensure as 'n bron van die misleidende sein geïmpliseer het.

Daardie persentasies beskryf verskillende metings op die studie se preparate, nie 'n universele korreksiefaktor nie. Die nuttige les is om vas te stel wat die sein veroorsaak het. In 'n biofilm kan 'n nukleïensuurkleurstof materiaal buite die selle sowel as binne beskadigde selle opspoor. Vir 'n gevolgtrekking oor lewensvatbaarheid beveel die navorsers aanvullende metings aan, soos kweekbaarheid of metaboliese aktiwiteit, terwyl hulle erken dat elke metode beperkings het.

Kontroleer wat die alternatief werklik bevat

'n Alternatiewe kleuringsmetode kan steeds metileenblou bevat. Giemsa is 'n voorbeeld: Merck beskryf sy produk as 'n azure-eosin-methylene-blue-oplossing, bedoel vir toepassings wat bloed- en beenmurgsmere insluit. Dit kan 'n ander metode vir 'n ander monster wees, maar voldoen nie aan 'n vereiste om metileenblou uit te sluit nie.

As die uitsluiting van 'n verbinding deel van die eksperiment is, kontroleer die identiteit en formulering van die reagens voordat beelde vergelyk word. Die gids oor methyl blue, methylene blue en kleurstowwe met soortgelyke name behandel die naamverskille.

Verifieer die vervanging voordat jy die resultaat gebruik

Maak vir 'n nuwe metode 'n klein vergelyking met verteenwoordigende monsters en 'n geskikte kontrole. Hou die mikroskoopinstellings waar moontlik vergelykbaar. Teken die reagensformulering, monsterpreparering, blootstelling en beeldvormingstoestande aan sodat 'n beeld wat beter lyk, ondersoek kan word eerder as bloot verkies word.

Beoordeel sukses volgens die oorspronklike vraag. Beoordeel vir morfologie of selgrense en rangskikking interpreteerbaar bly. Beoordeel vir kernmerking die ligging van die sein en die agtergrond. Vereis vir lewensvatbaarheid bewyse wat verder gaan as 'n aantreklike kleurskeiding. Die breër gids oor metileenbloukleuring en laboratoriumtoepassings verduidelik hoe die waarneming en die voorbereiding bymekaar pas.

Kies die alternatief wat die meting wat jy benodig, behou. Kleur is slegs een eienskap van die uiteindelike beeld.