洛夫勒碱性亚甲蓝与多色亚甲蓝染色解析

三瓶染色液可以并排放在染色台上，每瓶标签都带有某种形式的亚甲蓝。其中一瓶写着 1% 水性亚甲蓝。一瓶写着洛夫勒碱性亚甲蓝。一瓶写着多色亚甲蓝。忙碌的工作人员会拿起距离最近的一瓶。随后涂片可能染色过浅，或者均匀呈蓝色，或者出现意料之外的紫色色调，最终问题却被归咎于样本。

这是配方问题，而不是样本问题。这三种溶液含有相关染料，但体现了不同的染色理念。一种是在接近中性 pH 下的简单阳离子染料。一种是通过碱使同一种染料变得更具作用力。另一种则已经不再是单一染料，而是经过刻意氧化形成的混合物。使用错误的染液，染色原理会在操作过程中发生改变。

简短答案

普通水性亚甲蓝是基础形式：约 1% 染料溶于水，是一种用于细菌形态和一般显微镜观察的简单阳离子染色剂。洛夫勒碱性亚甲蓝是在醇性储备液稀释于水后加入少量经过测量的稀碱，使 pH 升高，从而增强阳离子染料与酸性细菌结构的结合。多色亚甲蓝则是经过碱性条件下刻意熟化氧化的亚甲蓝，因此瓶中含有去甲基化同系物（azure A、azure B、azure C）、硫堇以及亚甲蓝残留物等混合成分，这种混合物会使不同结构呈现不同色调。

如果只记住一句话：碱化改变染色强度，而多色化改变染色颜色。

普通水性亚甲蓝：参考基准

最简单的配方是将亚甲蓝溶解于水中，通常为 1% w/v，不含碱，也不经过氧化。着色成分是带氯离子作为反离子的甲基硫堇阳离子，这是一种小型扁平吩噻嗪染料，PubChem 的亚甲蓝记录将其描述为氯化甲基硫堇。作为阳离子，它会结合核酸的磷酸骨架以及细菌细胞壁上的酸性基团，使细胞在浅色背景下呈蓝色。

它的优点是可预测性强。细胞核和细菌呈蓝色。对比度适中。微弱染色的微生物可能显示不明显，这正是洛夫勒试图解决的问题。对于该类简单细菌染色剂的更广泛介绍，请参阅细菌简单染色概述。身份区分在这里仍然重要：甲基蓝是完全不同的分子，正如甲基蓝与亚甲蓝对比所解释的那样，因此仅根据颜色名称搜索目录可能会得到错误的染料类别。

洛夫勒碱性亚甲蓝：相同染料，增强作用

经典洛夫勒配方将醇性亚甲蓝储备液与水中的稀碱混合。教材版本通常要求将 0.3 g 染料加入 30 mL 95% 乙醇中，再加入 100 mL 0.01% 氢氧化钾水溶液（或等效地，将 30 mL 饱和醇性亚甲蓝、100 mL 蒸馏水和 1 mL 1% KOH 混合），得到约含 0.3% 染料且具有明显碱性的工作液。商业版本遵循相同原理，Thermo Fisher 微生物染色目录将洛夫勒碱性亚甲蓝、多色亚甲蓝和水性变体列为不同目录产品，并分别标明其用途。

碱性条件是其中的核心理念。提高 pH 会使样本中的羧基和磷酸基团去质子化，增加负电位点密度，而乙醇储备液保持染料充分溶解，使其以单体形式到达这些位点。结果是，与中性水性染料相比，细菌染色更快、更强，常规细菌涂片中的深蓝色杆菌和球菌更为明显。染色时间通常为一至三分钟，然后用水冲洗。

经典应用是生长于洛夫勒血清培养基上的白喉棒状杆菌：细长、通常呈棒槌状的杆菌，其中储存多聚磷酸盐的 Babes-Ernst 异染颗粒会强烈着色。培养基和染液的组合具有历史意义，两者都归功于同一位细菌学家，而颗粒对比度正是其价值所在。除白喉检测外，该染色剂还可作为一般细菌染色剂，用于培养物涂片、临床涂片中的奈瑟菌形态观察，以及不需要革兰氏染色但普通水性蓝染色过浅的情况。它是一种单色染色。所有酸性结构都会呈现某种蓝色。当方案要求颜色区分时，仅靠碱性条件无法提供这种效果。

一个实际注意事项：碱性染料溶液在储存过程中会因吸收二氧化碳而变质并产生沉淀。实验室通常制备少量溶液，或购买目录中的标准溶液并遵守其保质期，而不是长期保存旧瓶，使沉淀不断附着在每张载玻片上。

多色亚甲蓝：一个名称，多种染料

多色亚甲蓝从相同染料开始，但通过碱性条件下的受控氧化处理，使其经历传统称为熟化或多色化的过程。碱性老化、碳酸盐加热，或使用重铬酸盐等氧化剂，会逐步从二甲氨基取代基中去除甲基。产物是一种混合物：残余亚甲蓝，加上 azure B（失去一个甲基）、azure A 和 azure C（进一步去甲基化）、硫堇（完全去甲基化），以及亚甲紫家族的氧化副产物。每种成分都有自身的色调和组织亲和性，因此该混合物会产生异染现象：细胞核、颗粒、黏蛋白和软骨会分别呈现不同的蓝色至红紫色色调。

这种化学过程正是著名血液染色背后的相同化学原理。早期研究人员发现，碱化亚甲蓝可以使疟原虫细胞核呈现紫色色调，但其水性熟化溶液不稳定，并会在数日内产生沉淀。紫色血液染色发明过程的综述追溯了 Malachowski 和 Romanowsky 如何在 1891 年分别利用这一效应，甲醇如何被引入以稳定染料沉淀并在无需加热的情况下固定涂片，以及 Giemsa 后来如何通过测定比例的 azure B 加伊红并使用甘油稳定化来标准化该混合物。现代 Giemsa 类染色剂直接来源于多色亚甲蓝加伊红，这一组合产生 Romanowsky 效应。有关伊红组合以及 azure B 成分的详细信息，请参阅Romanowsky 型染色剂与 azure B 伊红相互作用。

由于它是一种混合物，多色亚甲蓝天然是三者中标准化程度最低的一种。其准确色彩平衡取决于氧化路径和程度，因此组织学供应商会将其作为具有独立性能测试的产品销售，而不是作为老化后的洛夫勒液。典型用途包括肥大细胞颗粒、黏蛋白和软骨的异染显示，浆细胞细节观察，以及通过 Goodpasture 型多色方法检测组织切片中的幽门螺杆菌。当问题是通过颜色进行区分时，它是正确选择；当方案要求清晰的单色细菌轮廓时，它则不是合适选择。

配方和用途比较

将表格视为决策流程。如果样本染色过浅，改变 pH 概念并选择洛夫勒液。如果所有结构都染色但没有明显区分，改变染料概念并选择多色亚甲蓝。如果洛夫勒涂片能够很好显示颗粒，但主管询问为什么细胞核和细胞质都呈现同一种蓝色，答案是任何碱性单色染色都无法完成这一任务。这个问题属于多色家族及其血液染色衍生物的范畴。

避免常见混淆

两种错误造成了大部分混淆。第一种是因为洛夫勒液和普通亚甲蓝在瓶中都呈蓝色，就认为两者可以互换。它们在 pH 和强度上不同，因此在指定洛夫勒液的情况下替换为中性染料，会失去方案设计所依赖的颗粒对比效果。第二种是将任何陈旧或意外老化的碱性蓝液视为多色亚甲蓝。不可控老化会产生未知组成和未知浓度的混合物，而真正的多色溶液通过确定的氧化路径制备，并且在血液染色体系中与测定比例的伊红结合。历史在这里具有启发意义：19 世纪 90 年代不稳定的水性熟化溶液后来被甲醇稳定化配方取代，正是因为不可控混合物无法重复，这一点值得在使用存放时间不明的染液进行诊断载玻片染色前牢记。

名称规范能够解决最后的问题。确认目录项目（水性、洛夫勒或多色）、染料含量以及标签上的预期用途，而不是根据颜色进行推断。这三种配方拥有共同的发色团祖先，但用途并不相同。