קען מעטילען־בלוי אַרומגיין מיטאָכאָנדריאַלן קאָמפּלעקס III? פֿאַר וואָס שטודיעס זענען נישט מסכּים

צוויי לאַבאָראַטאָריעס האָבן געפֿרעגט צי מעטילען־בלוי קען אַרומגיין אַ בלאָקירטן מיטאָכאָנדריאַלן קאָמפּלעקס III. איינע האָט געענטפֿערט ניין. די אַנדערע האָט געענטפֿערט יאָ. ביידע האָבן געהאַט דאַטן.

די ערשטע שטודיע, מיט מיטאָכאָנדריעס פֿון מײַז־מוחות, האָט געפֿונען אַז דער פֿאַרבשטאָף קען דאָס נישט. די צווייטע, מיט מוח־מיטאָכאָנדריעס פֿון דרײַ מינים ראָודאַנץ, האָט געפֿונען אַז ער קען דאָס טיילווײַז. אַ דריטע שטודיע, מיט מײַז־לעבער, ווערט אָפֿט ציטירט אין דעם זעלבן קאָנטעקסט, אָבער זי האָט געפּרוּווט עפּעס אַנדערש. האַלט מען זי אין איר ריכטיקן אָרט, ווערט אַ העלפֿט פֿון דער צעמישונג פֿאַרקלערט.

עס איז נישטאָ קיין אוניווערסאַלער מעכאַניזם צו אַנאָנסירן. עס זענען דאָ דרײַ עקספּערימענטן מיט פֿאַרשידענע בלאָקירער, דאָזעס און מעס־רעזולטאַטן. לייענט ערשט די באַדינגונגען. די מסקנות קומען דערנאָך.

וואָס אַרומגייונג מיינט דאָ

עלעקטראָנען קומען אַרײַן אין דער קייט דורך קאָמפּלעקס I (פֿון NADH) אָדער קאָמפּלעקס II (פֿון סוקצינאַט), גייען דורך קאָמפּלעקס III צו ציטאָכראָם c, און דערנאָך דורך קאָמפּלעקס IV צו זויערשטאָף. דער גראַדיענט וואָס ווערט אויפֿגעבויט אויפֿן וועג איז וואָס די צעל ניצט צו פּראָדוצירן ATP.

אַ טענה וועגן אַרומגייונג זאָגט אַז מעטילען־בלוי נעמט אויף עלעקטראָנען פֿאַר אַ בלאָקירונג און גיט זיי איבער נאָך איר. דער אָקסידירטער פֿאַרבשטאָף נעמט עלעקטראָנען פֿון NADH אָדער פֿון פֿריִע קאָמפּאָנענטן אין דער קייט און ווערט לעוקאָמעטילען־בלוי, און די רעדוצירטע פֿאָרעם גיט זיי איבער צו ציטאָכראָם c אָדער צוריק אין דער קייט. אויב די איבערגאַבע קומט פֿאָר נאָך דער בלאָקירונג, ווערן רעספּיראַציע און מעמבראַן־פּאָטענציאַל טיילווײַז צוריקגעשטעלט. אויב זי קומט פֿאָר בײַ דער בלאָקירונג אָדער פֿאַר איר, ווערט גאָרנישט צוריקגעשטעלט.

איין פּרט פֿון קאָמפּלעקס III באַשטימט אַ גרויסן טייל פֿון דער דאָזיקער מחלוקת. דער קאָמפּלעקס פֿירט אויס אַ Q־ציקל מיט צוויי אינכיביטאָר־בינדונגספּלעצער. אַנטימיצין בינדט זיך צום Qi־פּלאַץ. מיקסאָטיאַזאָל בינדט זיך צום Qo־פּלאַץ. אַ שטודיע וואָס ניצט נאָר איינעם פֿון זיי האָט געפּרוּווט נאָר אַ העלפֿט פֿונעם קאָמפּלעקס.

ערשטע שטודיע: קיין אַרומגייונג אין מיטאָכאָנדריעס פֿון מײַז־מוחות

Gureev און קאָלעגן האָבן געניצט מיטאָכאָנדריעס פֿון דער מוח־קאָרטעקס פֿון C57BL/6־מײַז, איזאָלירט מיט דיגיטאָנין, און געמאָסטן בײַ 0.1 mg פּראָטעין פּער ml. די סובסטראַטן האָבן אַרומגענומען דרײַ באַדינגונגס־סעטן: פּירווואַט מיט מאַלאַט בײַ 5 mM יעדער, סוקצינאַט בײַ 10 mM מיט גלוטאַמאַט בײַ 2 mM, און L־פּראָלין בײַ 10 mM. די בלאָקירער זענען געווען ראָטענאָן בײַ 1 micromolar (קאָמפּלעקס I) און אַנטימיצין בײַ 1 microgram פּער ml (קאָמפּלעקס III). די פֿאַרבשטאָף־דאָזעס זענען געווען 0.5, 1 און 2 micromolar, מיט 1 micromolar ווי דער הויפּט־קאָנצענטראַציע. די מעטאָדן און מעס־קורוון געפֿינען זיך אין דער קורצער פּובליקאַציע אין FEBS Letters.

די אַרומגייונג פֿון קאָמפּלעקס I האָט געאַרבעט. ראָטענאָן האָט פֿאַרמינערט די דורך ADP סטימולירטע רעספּיראַציע פֿון בערך 121 צו בערך 2 nmol פּער מינוט פּער mg, און 1 micromolar פֿאַרבשטאָף האָט זי צוריקגעבראַכט צו בערך 21. דער מעמבראַן־פּאָטענציאַל האָט זיך צוריקגעשטעלט מיט פּירווואַט און מאַלאַט, און מיט L־פּראָלין.

די אַרומגייונג פֿון קאָמפּלעקס III האָט נישט געאַרבעט. אַנטימיצין האָט פֿאַרמינערט די רעספּיראַציע צו בערך 16, און דער פֿאַרבשטאָף האָט זי געבראַכט נאָר צו בערך 20. דער מעמבראַן־פּאָטענציאַל האָט זיך נישט צוריקגעשטעלט מיט קיין סובסטראַט, בײַ פֿאַרבשטאָף־דאָזעס ביז 5 micromolar. די פּעראָקסיד־דאַטן האָבן געוויזן אין דער זעלבער ריכטונג: דער פֿאַרבשטאָף אַליין האָט פֿאַרגרעסערט די פּעראָקסיד־אַרויסלאָזונג פֿון אַ באַזאַלן קורס פֿון נאָענט צו 76 pmol פּער מינוט פּער mg צו בערך 1170, 1460 און 1945 בײַ די דרײַ דאָזעס, אָבער אַנטימיצין האָט פֿאַרמינערט דעם דורך פֿאַרבשטאָף געטריבענעם סיגנאַל מיט בערך 25, 88 און 96 פּראָצענט, רעספּעקטיוו. אויב דער רעדוצירטער פֿאַרבשטאָף וואָלט רעאַגירט גלײַך מיט זויערשטאָף, וואָלט אַ בלאָקירונג פֿון קאָמפּלעקס III נישט געדאַרפֿט אונטערדריקן דעם סיגנאַל. די מחברים האָבן דערפֿון אַרויסגעפֿירט אַז דער רעדוצירטער פֿאַרבשטאָף ווערט אָקסידירט בײַם Qo־פּלאַץ פֿון קאָמפּלעקס III, פֿאַר דער אַנטימיצין־בלאָקירונג. דער קורצער קרײַז, אין ווערטער: דאָנאָרן צום פֿאַרבשטאָף, פֿאַרבשטאָף צו Qo, און ווײַטער אויפֿן געוויינטלעכן וועג. ראָטענאָן ווערט אַרומגעגאַנגען. אַנטימיצין נישט.

צווייטע שטודיע: טיילווײַזע אַרומגייונג אין דרײַ מינים, בײַ ביידע אינכיביטאָר־בינדונגספּלעצער

Svab און קאָלעגן האָבן פֿאַרברייטערט דעם עקספּערימענטעלן פּלאַן. מוח־מיטאָכאָנדריעס פֿון מײַז, ראַטן און מערשוויינלעך, איזאָלירט מיט Percoll, זענען געמאָסטן געוואָרן בײַ די זעלבע 0.1 mg פּער ml, מיט פּירווואַט און מאַלאַט אָדער גלוטאַמאַט און מאַלאַט בײַ 5 mM יעדער. זיי האָבן געניצט צוויי בלאָקירער פֿון קאָמפּלעקס III: אַנטימיצין A בײַ 0.3 micromolar און מיקסאָטיאַזאָל בײַ 1 micromolar. דער פֿאַרבשטאָף איז געווען בײַ 2 micromolar אין רובֿ מעסונגען, און בײַ 0.5 אין דער אַרבעט מיט ציטאָכראָם c. אַלע דרײַ מינים מיט צוגעפּאַסטע פּראָטאָקאָלן ווערן באַשריבן אין דעם פֿרײַ צוטריטלעכן אַרטיקל.

ביידע בלאָקירונגען זענען טיילווײַז אַרומגעגאַנגען געוואָרן, אין אַלע דרײַ מינים. אין מײַז־מיטאָכאָנדריעס האָט אַנטימיצין אונטערדריקט די רעספּיראַציע, און דער פֿאַרבשטאָף האָט זי פֿאַרגרעסערט מיט בערך 60 פּראָצענט, פֿון בערך 37 צו 59 nmol פּער מינוט פּער mg. מיקסאָטיאַזאָל האָט זי אונטערדריקט מיט 88 פּראָצענט, צו בערך 4.5, און דער פֿאַרבשטאָף האָט זי פֿאַרגרעסערט פֿינף מאָל, צו בערך 23. דער מעמבראַן־פּאָטענציאַל האָט זיך טיילווײַז רעפּאָלאַריזירט אונטער יעדן פֿון די אינכיביטאָרן; ער איז געמאָסטן געוואָרן מיט צוויי פֿאַרבשטאָפֿן (סאַפֿראַנין O און ראַטיאָמעטרישן TMRM), כּדי אויסצושליסן אָפּטישע אַרטעפֿאַקטן.

דער אַרטיקל האָט אויך דירעקט געפּרוּווט די איבערגאַבע, וואָס די ערשטע שטודיע האָט קיינמאָל נישט געטאָן. אויסערלעך צוגעגעבענער אַצעטילירטער ציטאָכראָם c בײַ 25 micromolar איז נישט רעדוצירט געוואָרן דורך ענערגיזירטע מיטאָכאָנדריעס, מיט אָדער אָן אינכיביטאָרן, אָבער צוגעבן דעם פֿאַרבשטאָף האָט געטריבן די רעדוקציע אין ביידע פֿאַלן. אין אַ צעל־פֿרײַער בופֿער־לייזונג האָט NADH מיט פֿאַרבשטאָף רעדוצירט ציטאָכראָם c מיט אַ קורס פּראָפּאָרציאָנעל צו NADH. דער לענגערער שפּרונג, אין ווערטער: רעדוקציע־עקוויוואַלענטן צום פֿאַרבשטאָף, פֿאַרבשטאָף גלײַך צו ציטאָכראָם c, קאָמפּלעקס IV צו זויערשטאָף. דער וועג שפּרינגט גאָר איבער קאָמפּלעקס III, אַזוי אַז ביידע בלאָקירער קענען אַרומגעגאַנגען ווערן.

צוויי נאָך מעס־רעזולטאַטן שטיצן דעם אויסטײַטש. די NAD(P)H־פֿלואָרעסצענץ איז געפֿאַלן ווען מען האָט צוגעגעבן פֿאַרבשטאָף צו מיט מיקסאָטיאַזאָל באַהאַנדלטע מיטאָכאָנדריעס, דאָס הייסט אַז רעדוקציע־עקוויוואַלענטן זענען אַוועקגעפֿלאָסן דורך דעם נײַעם וועג. און די ליכט־אַבזאָרפּציע פֿונעם פֿאַרבשטאָף בײַ 660 nm האָט אָפּגעשפּיגלט יעדע צוגעבונג נאָכאַנאַנד, בעת די איבערשטייענדיקע פֿליסיקייטן נאָך צענטריפֿוגירן האָבן געוויזן אַז דער אָקסידירטער פֿאַרבשטאָף האָט זיך קאָנצענטרירט אין ענערגיזירטע מיטאָכאָנדריעס מער ווי הונדערט מאָל, און איז דערנאָך אַרויסגעגאַנגען ווען דער פּאָטענציאַל איז צונויפֿגעפֿאַלן. די פּראָטאָן־בילאַנץ פּאַסט אויך: איבערשפּרינגען די פּאָמפּיר־טריט לאָזט איבער בערך 2 פּראָטאָנען פּער עלעקטראָן־פּאָר אַנשטאָט 10, אַזוי אַז גיכערער זויערשטאָף־פֿאַרברויך מיט נאָר טיילווײַזער רעפּאָלאַריזאַציע איז ווי אַן אמתע אַרומגייונג זעט אויס, נישט קיין באַווײַז קעגן איר.

די זעלבע פּרעפּאַראַציע האָט אַרויסגעוויזן רעאַקציעס וואָס מאַכן אַן אויבערפֿלעכלעכע לייענונג פֿאַרפֿירעריש. מיט אינכיביטאָר און פֿאַרבשטאָף האָט ADP פֿאַרמינערט די רעספּיראַציע אַנשטאָט זי צו פֿאַרגרעסערן, און אַ טראַנספּאָרט־בלאָקירונג האָט זי סטימולירט אַנשטאָט זי צו פֿאַרלאַנגזאַמען, בעת דער מעמבראַן־פּאָטענציאַל האָט זיך נאָך אַלץ געביטן אין די געוויינטלעכע ריכטונגען. זויערשטאָף־פֿאַרברויך אַליין פֿירט צו פֿאַלשע מסקנות אין דעם סיסטעם.

דריטע שטודיע: די לעבער־שטודיע וואָס האָט געפּרוּווט קאָמפּלעקסן I און II, נישט III

Lee און Boelsterli האָבן געניצט מײַז־לעבער־מיטאָכאָנדריעס און קולטיווירטע העפּאַטאָציטן, געשעדיקט דורך עפֿאַווירענז (קאָמפּלעקס I, IC50 נאָענט צו 30 micromolar) און הידראַזין, דעם מעטאַבאָליט פֿון איזאָניאַזיד (קאָמפּלעקס II, IC50 נאָענט צו 30 micromolar). פֿאַרבשטאָף בײַ בערך 30 micromolar האָט צוריקגעשטעלט NADH־אָקסידאַציע, מעמבראַן־פּאָטענציאַל און ATP, בעת ער האָט פֿאַרמינערט אָקסידאַנטן און נעקראָטישן צעל־טויט. דער אַרטיקל אין Redox Biology מאָדעלירט דאָס ווי אַ פֿאַרבשטאָף וואָס טראָגט עלעקטראָנען אַרום די געשעדיקטע קאָמפּלעקסן I און II.

דער רעזולטאַט איז אַ באַשטעטיקטער קאָנטעקסט וועגן פֿריִערדיקע טיילן פֿון דער קייט, און ער זאָגט גאָרנישט וועגן קאָמפּלעקס III, ווײַל דאָרט איז גאָרנישט געווען בלאָקירט. ער קען נישט באַשטעטיקן אָדער אָפּוואַרפֿן קיין איינע פֿון די מוח־שטודיעס.

די באַדינגונגען־מאַטריץ

פֿיר סיבות פֿאַר וואָס ביידע שטודיעס פֿון קאָמפּלעקס III קענען זײַן ריכטיק וועגן זייער אייגענעם עקספּערימענט

1. דער בלאָקירער איז נישט געווען די זעלבע אינטערווענץ. אַנטימיצין אַליין בײַ 1 microgram פּער ml קעגן אַנטימיצין בײַ 0.3 micromolar מיט אַ באַזונדערן בלאָקירער פֿונעם Qo־פּלאַץ. אַ פֿאַרבשטאָף־וועג וואָס פֿירט צום Qo־פּלאַץ דורכפֿאַלט פּונקט וווּ אַ דירעקטער וועג צו ציטאָכראָם c האָט הצלחה. איין בינדונגספּלאַץ קען נישט פֿאַרטרעטן ביידע.

2. די פֿאַרבשטאָף־דאָזע און דער צײַטפּלאַן זענען געווען אַנדערש. הויפּט־קאָנצענטראַציעס פֿון 1 קעגן 2 micromolar, בײַ אַ רעדאָקס־ציקלירנדיקן שטאָף וועמענס אויפֿנאַם און דירעקטע רעדוקציע פֿון ציטאָכראָם c זענען אָפּהענגיק פֿון קאָנצענטראַציע און צײַט. קליינע דאָזע־חילוקים מיט פֿאַרשידענע מעס־צײַטפּונקטן קענען אַנטפּלעקן פֿאַרשידענע צווייגן פֿון איין נעץ.

3. די פּרעפּאַראַציעס זענען געווען אַנדערש. איזאָלירן מיט דיגיטאָנין קעגן איזאָלירן דורך אַ Percoll־גראַדיענט סעלעקטירט מיטאָכאָנדריאַלע פּאָפּולאַציעס וואָס דעקן זיך טיילווײַז, אָבער זענען נישט אידענטיש. די פּראָטעין־קאָנצענטראַציע איז געווען גלײַך, בײַ 0.1 mg פּער ml, אַזוי אַז דער פֿאַקטאָר פֿאַלט אַוועק, אָבער די אונטערפּאָפּולאַציע און די סטרוקטורעלע אינטעגריטעט נישט. און דער מין־חילוק איז אויסגעשלאָסן געוואָרן ווי אַ חשד: די צווייטע גרופּע האָט רעפּראָדוצירט איר פֿענאָטיפּ אויך אין מײַז.

4. דער סובסטראַט־צושטאַנד באַשטימט וואָס דער פֿאַרבשטאָף קען טאָן. דרײַ סובסטראַט־סעטן קעגן פּאָרן פֿאַרבונדן מיט NADH. די NADH־צושטעלונג און דער מעמבראַן־פּאָטענציאַל באַשטימען צוזאַמען ווי גיך דער פֿאַרבשטאָף ווערט רעדוצירט און וווּ ער פֿאַרטיילט זיך, און אַ וועג וואָס דאַרף רעדוצירטן פֿאַרבשטאָף לעבן אָקסידירטן ציטאָכראָם c איז אָפּהענגיק פֿון דער אויסוואַל.

ווי צו לייענען די קומענדיקע טענה וועגן אַרומגייונג

פֿרעגט וועלכער קאָמפּלעקס איז געווען בלאָקירט, מיט וועלכן אינכיביטאָר, בײַ וועלכן בינדונגספּלאַץ און אין וועלכער דאָזע. פֿרעגט וואָס איז געווען די פֿאַרבשטאָף־קאָנצענטראַציע און ווען די מעסונג איז גענומען געוואָרן. פֿרעגט וועגן געוועב, מין, איזאָליר־מעטאָד, פּראָטעין־קאָנצענטראַציע און סובסטראַט. און פֿרעגט צי פּאָטענציאַל, רעספּיראַציע, רעדאָקס־צושטאַנד און אַ דירעקטע איבערגאַבע־פּראָבע שטימען איינס מיטן אַנדערן, ווײַל זויערשטאָף־פֿאַרברויך אַליין האָט דאָ מער ווי איין מאָל אָנגעוויזן אין דער פֿאַלשער ריכטונג.

דער ענגער סיכום בלײַבט גילטיק. וועגן דער אַרומגייונג פֿון קאָמפּלעקס I דורך פֿאַרבשטאָף איז מען מסכּים. בײַ קאָמפּלעקס III ווײַזן מײַז־מיטאָכאָנדריעס מיט אַנטימיצין בײַ 1 microgram פּער ml און פֿאַרבשטאָף בײַ 1 micromolar קיין פֿונקציאָנעלע אַרומגייונג נישט, בעת דרײַ מינים מיט אַנטימיצין בײַ 0.3 micromolar אָדער מיקסאָטיאַזאָל בײַ 1 micromolar און פֿאַרבשטאָף בײַ 2 micromolar ווײַזן אַ טיילווײַזע אַרומגייונג מיט דירעקטער איבערגאַבע פֿון פֿאַרבשטאָף צו ציטאָכראָם c. די זאַצן קענען ביידע זײַן אמת. אַלץ וואָס גייט ווײַטער איז עקסטראַפּאָלאַציע.

פֿאַרבונדענע לייענמאַטעריאַלן האַלטן די טענה אין מחלוקת אינעם ראַם פֿון באַשטעטיקטער כעמיע: ווי מעטילען־בלוי באַוועגט עלעקטראָנען וועגן דער איבערגאַבע־קייט, די עקספּערימענטן מיט דער אַרומגייונג פֿון קאָמפּלעקס I וועגן דעם באַשטעטיקטן פֿאַל אין די פֿריִערדיקע טיילן פֿון דער קייט, מעסונגען פֿון מעמבראַן־פּאָטענציאַל און זייערע אַרטעפֿאַקטן וועגן פֿאַר וואָס צוויי פֿאַרבשטאָפֿן זענען געווען נייטיק, און לאַבאָראַטאָרישע באַהאַנדלונג פֿון רעדאָקס־ציקלירנדיקע שטאָפֿן וועגן די פּאַסטקעס פֿון דאָזירונג און צײַטפּלאַן.