אַלטערנאַטיוון צו מעטהילען־בלוי פֿאַר מיקראָסקאָפּיע: קלײַבט לויט דער אויפֿגאַבע

פֿאַר אַן פּשוטן באַקטעריעלן אויסשמיר קען קריסטאַל־פֿיאָלעט פֿאַרבײַטן מעטהילען־בלוי ווען דער ציל איז צו זען די צעל־פֿאָרעם. פֿאַר לעבעדיקע צעלן קען אַ בעסערע אַלטערנאַטיוו זײַן פֿאַזע־קאָנטראַסט גאָר אָן קיין פֿאַרבונג. די ברירה ווענדט זיך אין דער אָבסערוואַציע וואָס איר דאַרפֿט מאַכן.

שטעלט זיך פֿאָר אַז צוויי מענטשן באַטראַכטן די זעלבע באַקטעריעלע קולטור. איינער וויל אונטערשיידן שטעכלעך־פֿאָרמיקע צעלן פֿון רונדיקע צעלן. דער צווייטער וויל וויסן צי אַ באַהאַנדלונג האָט אומגעבראַכט די באַקטעריעס. אַ פֿאַרבונג וואָס גיט דעם ערשטן אַ קלאָר בילד קען דעם צווייטן גאָר נישט געבן קיין ניצבאַרן ענטפֿער.

איידער איר קלײַבט אַ פֿאַרטרעטער, פֿאַרענדיקט דעם זאַץ: „איך דאַרף אָבסערווירן ___ אין ___, און די צעלן מוזן / דאַרפֿן נישט בלײַבן לעבעדיק.“ דער זאַץ באַשטימט די אויפֿגאַבע וואָס די פֿאַרבונג מוז אויספֿירן.

הייבט אָן מיט דער פּראָבע און דער פֿראַגע

באַשליסט ערשט צי די צעלן מוזן בלײַבן לעבעדיק, און דערנאָך באַשטימט וועלכן שטריך איר דאַרפֿט אָבסערווירן:

• די צעלן מוזן בלײַבן לעבעדיק: פֿאַר באַוועגונג אָדער פֿאָרעם באַטראַכט נישט־געפֿאַרבטן פֿאַזע־קאָנטראַסט אָדער DIC; פֿאַר קערן־DNA באַטראַכט Hoechst 33342 מיט פֿלואָרעסצענץ; פֿאַר מעמבראַן־אינטאַגריטעט קלײַבט אַ וואַלידירטן אַסיי, ווי SYTO 9 מיט propidium iodide.
• די צעלן דאַרפֿן נישט בלײַבן לעבעדיק: פֿאַר באַקטעריעלער מאָרפֿאָלאָגיע באַטראַכט אַ פּשוטע קריסטאַל־פֿיאָלעט־פֿאַרבונג אָדער אַ נעגאַטיווע ניגראָסין־פֿאַרבונג; פֿאַר Gram־רעאַקציע ניצט די גאַנצע Gram־פֿאַרבונג־מעטאָד; פֿאַר קערן־DNA אין פֿיקסירטע צעלן באַטראַכט DAPI־פֿלואָרעסצענץ.

ניצט די טאַבעלע כּדי צו פֿאַרגלײַכן די באַגרענעצונגען פֿון יעדן צווייג. דאָס זײַנען ברירות צווישן מעטאָדן, נישט אינסטרוקציעס צו פֿאַרבײַטן פֿלעשלעך אינעם ראַם פֿון אַן עקזיסטירנדיקן פּראָטאָקאָל.

פֿאַר אַן פּשוטן אויסשמיר, פֿאַרבײַט די מעטאָד מיט פֿאַרזיכטיקייט

קריסטאַל־פֿיאָלעט איז אַ פּראַקטישער קאַנדידאַט ווען די אויפֿגאַבע איז אַ איין־קאָליריקער בליק אויף באַקטעריעלער מאָרפֿאָלאָגיע. דער FDA'ס Bacteriological Analytical Manual רעכנט אויס צוויי קריסטאַל־פֿיאָלעט־פֿאָרמולאַציעס וואָס פּאַסן פֿאַר פּשוטער פֿאַרבונג. ניצט אַ דאָקומענטירטע פֿאָרמולאַציע און איר צוגרייטונג־מעטאָד; דער נאָמען פֿון פֿאַרב אַליין דעפֿינירט נישט קיין גרייט־צו־אַרבעטן רעאַגענט.

קריסטאַל־פֿיאָלעט קומט אויך פֿאָר אין Gram־פֿאַרבונג, אָבער דאָס מאַכט נישט אַ פּשוטע קריסטאַל־פֿיאָלעט־פֿאַרבונג פֿאַר אַ Gram־פֿאַרבונג. אינעם ASM Gram־פֿאַרבונג־פּראָטאָקאָל ווענדט זיך דער דיפֿערענציאַלער רעזולטאַט אין קריסטאַל־פֿיאָלעט, יוד, אָפּפֿאַרבונג און קעגן־פֿאַרבונג וואָס אַרבעטן איינס נאָך דעם אַנדערן. אויב מען לאָזט אויס יענע שריט, ענדערט זיך וואָס דאָס בילד קען באַשטעטיקן. זעט פּשוטע פֿאַרבונג קעגן Gram־פֿאַרבונג פֿאַר דעם אונטערשייד.

ניגראָסין גיט אַן אַנדער אופֿן צו ווײַזן קאָנטורן: עס פֿאַרטונקלט דעם הינטערגרונט, בשעת די באַקטעריעלע צעלן בלײַבן פֿאַרהעלטנישמעסיק ליכטיק. אין Merck'ס ניגראָסין־אינסטרוקציעס געפֿינט זיך אַ וויכטיקער פּרט וואָס אַ גענערישע רשימה פֿון פֿאַרטרעטערס קען פֿאַרפֿעלן. די ספּעציפֿיצירטע אַרבעטס־פֿאָרמולאַציע נעמט אַרײַן פֿאָרמאַלדעהיד. דעריבער קען מען נישט אויספֿירן פֿון די ווערטער „נעגאַטיווע פֿאַרבונג“ אַז עס איז קאָמפּאַטיבל מיט לעבעדיקע צעלן, אַפֿילו אויב די צעלן אַליין זעען אויס אומגעפֿאַרבט. קאָנטראָלירט די גאַנצע פֿאָרמולאַציע און די צוגרייטונג פֿון דער פּראָבע.

פֿאַר לעבעדיקע פּראָבעס, באַטראַכט צו טוישן די אָפּטיק

אויב איר ווילט נאָכפֿאָלגן ווי צעלן באַוועגן זיך אָדער טיילן זיך, קען אַרײַנפֿירן נאָך אַ פֿאַרב קאָמפּליצירן די אָבסערוואַציע. ווי Nikon דערקלערט אין זײַן וועגווײַזער וועגן קאָנטראַסט אין דורכזיכטיקע פּראָבעס, פֿאַזע־קאָנטראַסט און דיפֿערענציעלער אינטערפֿערענץ־קאָנטראַסט, אָדער DIC, מאַכן פּראָבעס זעבאַר דורך אונטערשיידן אין זייערע אָפּטישע אייגנשאַפֿטן. זיי קענען ווײַזן לעבעדיקע, אומגעפֿאַרבטע צעלן, אויב דער מיקראָסקאָפּ האָט די נויטיקע קאָמפּאָנענטן.

די ברירה באַוואַרט אַן אומגעפֿאַרבטע צוגרייטונג, אָבער זי ענדערט די אינפֿאָרמאַציע וואָס איז צוטריטלעך. איר קענט נאָכפֿאָלגן אַ גרענעץ אָדער אַ באַוועגונג אָן צו וויסן וועלכער מאָלעקול האָט געשאַפֿן דעם קאָנטראַסט. אויב די פֿראַגע איז מאָלעקולאַרע לאָקאַליזאַציע, קלײַבט אַנשטאָט אַ פּאַסיקע מאַרקירונג־מעטאָד.

פֿאַר קערן־DNA אונטערשיידט Invitrogen'ס פֿאַרגלײַך פֿון DAPI און Hoechst־פֿאַרבן צווישן DAPI'ס געוויינטלעכן באַניץ מיט פֿיקסירטע צעלן און דעם מער צעל־דורכדרינגלעכן Hoechst 33342, וואָס ווערט בילכער פֿאַר מאַרקירן לעבעדיקע צעלן. ביידע דאַרפֿן פֿלואָרעסצענץ־אויסריכטונג. קיינער פֿון זיי איז נישט קיין דירעקטער פֿאַרטרעטער פֿאַר אַ קאָלירטן ברייטפֿעלד־פֿאַרב.

באַהאַנדלט די אויסשטעלונג צום פֿאַרב און די באַלויכטונג ווי עקספּערימענטעלע באַדינגונגען. פֿאַרגלײַכט געפֿאַרבטע און אומגעפֿאַרבטע צוגרייטונגען ווען דאָס אויפֿפֿירן פֿון די צעלן איז אייער מעסטונג.

אַ רויטע צעל איז נישט אויטאָמאַטיש אַ טויטע צעל

SYTO 9 און propidium iodide ווערן אָפֿט געניצט צוזאַמען כּדי אָפּצושאצן באַקטעריעלע מעמבראַן־אינטאַגריטעט. דער BacLight־מאַנואַל פֿאַרבינדט אינטאַקטע מעמבראַנען מיט גרינער פֿאַרבונג און געשעדיקטע מעמבראַנען מיט רויטער פֿאַרבונג. יענע אינטערפּרעטאַציע דאַרף וואַלידאַציע פֿאַר דער באַטראַכטער פּראָבע.

אַ שטודיע פֿון 2019 פֿון Rosenberg און קאָלעגן אילוסטרירט דעם פּראָבלעם. אין 24־שעהיקע E. coli־ביאָפֿילמען אויף גלאָז אין פֿאָספֿאַט־באַפֿערטער זאַלין האָבן בערך 96% פֿון די צעלן אויסגעזען propidium-iodide-positive אין situ. אָבער די מחברים האָבן אָפּגעשאַצט אַז 82% זײַנען געווען קולטיווירבאַר נאָך דער איינזאַמלונג. קאָנפֿאָקאַלע בילדער האָבן געוויזן צעלן מיט גרינע אינעווייניקסטע טיילן אונטער רויט־געפֿאַרבטן מאַטעריאַל, וואָס האָט אָנגעוויזן אויף עקסטראַסעלולערע נוקלעיִנזויערן ווי אַ מקור פֿון דעם פֿאַרפֿירנדיקן סיגנאַל.

יענע פּראָצענטן באַשרײַבן פֿאַרשידענע מעסטונגען אויף די צוגרייטונגען פֿון דער שטודיע, נישט קיין אוניווערסעלן קאָרעקציע־פֿאַקטאָר. די נוצלעכע לערע איז צו קאָנטראָלירן וואָס האָט געשאַפֿן דעם סיגנאַל. אין אַ ביאָפֿילם קען אַ נוקלעיִנזויער־פֿאַרב דעטעקטירן מאַטעריאַל מחוץ די צעלן, ווי אויך אינעווייניק אין געשעדיקטע צעלן. פֿאַר אַ מסקנא וועגן לעבנספֿעיִקייט רעקאָמענדירן די פֿאָרשער קאָמפּלעמענטאַרע מעסטונגען, ווי קולטיווירונג אָדער מעטאַבאָלישע אַקטיוויטעט, בשעת זיי דערקענען אַז יעדע מעטאָד האָט באַגרענעצונגען.

קאָנטראָלירט וואָס די אַלטערנאַטיוו טאַקע כּולל

אַן אַלטערנאַטיווע פֿאַרבונג־מעטאָד קען נאָך אַלץ כּולל מעטהילען־בלוי. Giemsa איז אַ בײַשפּיל: Merck באַשרײַבט זײַן פּראָדוקט ווי אַן azure-eosin-methylene-blue לייזונג, באַשטימט פֿאַר אַפּליקאַציעס וואָס נעמען אַרײַן בלוט־ און ביין־מאַרך־אויסשמירעס. עס קען זײַן אַן אַנדער מעטאָד פֿאַר אַן אַנדער פּראָבע, אָבער עס דערפֿילט נישט קיין פֿאָדערונג אויסצושליסן מעטהילען־בלוי.

אויב אויסשליסן אַ קאַמפּאַונד איז אַ טייל פֿונעם עקספּערימענט, קאָנטראָלירט די אידענטיטעט און פֿאָרמולאַציע פֿונעם רעאַגענט איידער איר פֿאַרגלײַכט בילדער. דער וועגווײַזער וועגן methyl blue, methylene blue און פֿאַרבן מיט ענלעכע נעמען באַהאַנדלט די אונטערשיידן אין נעמען.

באַשטעטיקט די סובסטיטוציע איידער איר ניצט דעם רעזולטאַט

פֿאַר אַ נײַער מעטאָד, מאַכט אַ קליינעם פֿאַרגלײַך מיט רעפּרעזענטאַטיווע פּראָבעס און אַ פּאַסיקן קאָנטראָל. האַלט די מיקראָסקאָפּ־אײַנשטעלונגען פֿאַרגלײַכבאַר ווו מעגלעך. רעקאָרדירט די רעאַגענט־פֿאָרמולאַציע, צוגרייטונג פֿון דער פּראָבע, אויסשטעלונג און בילדגעבונג־באַדינגונגען, כּדי אַ בילד וואָס זעט אויס בעסער זאָל קענען ווערן אויסגעפֿאָרשט אַנשטאָט בלויז בילכער געמאַכט.

באַורטיילט הצלחה לויט דער אָריגינעלער פֿראַגע. פֿאַר מאָרפֿאָלאָגיע, באַורטיילט צי די צעל־גרענעצן און אָרדענונג בלײַבן אינטערפּרעטירבאַר. פֿאַר קערן־מאַרקירונג, באַורטיילט די אָרט פֿון סיגנאַל און דעם הינטערגרונט. פֿאַר לעבנספֿעיִקייט, פֿאָדערט באַווײַזן איבער אַן אַטראַקטיווער קאָליר־צעשיידונג hinaus. דער ברייטערער וועגווײַזער וועגן מעטהילען־בלוי־פֿאַרבונג און לאַבאָראַטאָרישע אַפּליקאַציעס דערקלערט ווי די אָבסערוואַציע און די צוגרייטונג פּאַסן זיך צונויף.

קלײַבט די אַלטערנאַטיוו וואָס באַוואַרט די מעסטונג וואָס איר דאַרפֿט. קאָליר איז בלויז איין אייגנשאַפֿט פֿונעם רעזולטירנדיקן בילד.