Xanh methylen và ATP: sử dụng nhiều oxy hơn có nghĩa là nhiều năng lượng hơn?

Một ty thể được phân lập nằm trong buồng đo có nhiên liệu nhưng không có ADP. Nó tiêu thụ oxy chậm. Khi thêm ADP, mức tiêu thụ oxy tăng lên vài lần. Đợi đến khi ADP cạn, mức tiêu thụ oxy lại giảm xuống. Nhiên liệu không hề thay đổi. Chỉ nhu cầu ATP thay đổi.

Chuỗi diễn biến ngắn đó chứa đựng toàn bộ sự khác biệt mà bài viết này đề cập. Mức tiêu thụ oxy đo tốc độ electron đi qua chuỗi hô hấp đến oxy. Quá trình sản xuất ATP đo lượng năng lượng có thể sử dụng được thu giữ từ dòng electron ấy. Hai quá trình có chung một bước trung gian: gradient proton qua màng trong ty thể. Bất cứ yếu tố nào làm thay đổi mức độ ghép cặp chặt chẽ giữa gradient này và quá trình tổng hợp ATP đều có thể khiến hai chỉ tiêu biến đổi theo những hướng khác nhau. Xanh methylen là một ví dụ hữu ích ở đây vì người ta đã quan sát thấy cả hai kiểu tác động: làm tăng mức sử dụng oxy cùng với ATP trong một số chế phẩm, và làm tăng mức sử dụng oxy trong khi ATP không đổi hoặc giảm ở những chế phẩm khác.

Độc giả muốn có cái nhìn tổng quát về cơ chế chuyển tiếp electron trước có thể bắt đầu với cách xanh methylen chuyển electron qua chuỗi hô hấp; còn độc giả muốn hiểu các thuật ngữ trong những thí nghiệm oxy ban đầu có thể đọc về những gì các phép đo hô hấp đầu tiên thực sự cho thấy.

Hô hấp, ATP và gradient nối giữa chúng

Electron từ NADH và FADH2 đi vào chuỗi tại phức hợp I và II, qua phức hợp III đến cytochrome c, rồi qua phức hợp IV đến oxy. Năng lượng giải phóng tại các phức hợp I, III và IV bơm proton từ chất nền ty thể ra khoang gian màng. Sự phân tách điện tích và độ axit này tạo nên động lực proton, trong đó thành phần điện, tức điện thế màng, thường chiếm ưu thế.

ATP synthase cho proton chảy trở lại chất nền ty thể và sử dụng năng lượng giải phóng để kết hợp ADP với phosphate thành ATP. Vì vậy, chuỗi quá trình là:

tiêu thụ oxy, rồi bơm proton, rồi tạo gradient, rồi tổng hợp ATP.

Điểm cần lưu ý là proton có thể trở về theo những con đường khác. Bất kỳ dòng proton trở về nào không đi qua ATP synthase đều là rò rỉ proton. Rò rỉ buộc chuỗi hô hấp phải bơm lại chính những proton đó để giữ điện thế màng ổn định, khiến oxy được tiêu thụ nhiều hơn mà không tạo thêm ATP. Khi rò rỉ đủ mạnh, sự tách ghép xảy ra: mức sử dụng oxy tăng trong khi ATP không đổi hoặc giảm, còn năng lượng không được thu giữ thoát ra dưới dạng nhiệt.

Trạng thái 3, trạng thái 4 và tỷ số kiểm soát hô hấp

Hệ thuật ngữ kinh điển này bắt nguồn từ các thí nghiệm trên ty thể phân lập. Trạng thái 3 là hô hấp khi có cả cơ chất và ADP: ATP synthase làm giảm gradient, điện thế màng hạ xuống, chuỗi hô hấp tăng tốc để tái lập gradient, và mức sử dụng oxy cao vì ATP đang được tạo ra. Trạng thái 4 là hô hấp sau khi ADP cạn: ATP synthase gần như ngừng hoạt động, gradient tăng lên, điện thế màng cao cản trở việc tiếp tục bơm proton, và mức sử dụng oxy giảm xuống chỉ còn đủ để bù cho sự rò rỉ.

Vì vậy, tỷ số kiểm soát hô hấp, tức trạng thái 3 chia cho trạng thái 4, phản ánh mức độ ghép cặp chặt chẽ của chế phẩm. Tỷ số cao nghĩa là ADP kiểm soát hô hấp mạnh. Tỷ số giảm trong khi trạng thái 4 tăng cho thấy rò rỉ đang trở thành yếu tố chi phối. Đây là góc nhìn giúp lý giải các kết quả về xanh methylen bên dưới.

Có một mô hình tư duy đáng ghi nhớ. Điện thế màng cao làm chuỗi hô hấp chậm lại. Làm tiêu tán điện thế sẽ khiến chuỗi tăng tốc. Chuỗi phản ứng với mức độ khó khăn của việc bơm proton, chứ không trực tiếp phản ứng với việc ATP có đang được tạo ra hay không.

Khi các chỉ tiêu thay đổi cùng nhau

Ví dụ rõ nhất về sự ghép cặp đến từ ty thể não chuột lang phân lập có các phức hợp hô hấp bị chặn. Ở nồng độ xanh methylen từ 100 nanomolar đến 1 micromolar, mức tiêu thụ oxy khi nghỉ tăng với nhiên liệu là glutamate kết hợp malate, succinate hoặc glycerophosphate, trong khi hô hấp được ADP kích thích không thay đổi. Ở ty thể bị đầu độc tại phức hợp I hoặc phức hợp III, chất màu này làm tăng vừa phải quá trình sản xuất ATP, khôi phục điện thế màng và cải thiện khả năng thu nhận canxi. Con đường được đề xuất là một lối tắt: chất màu nhận electron ở phía trước điểm bị chặn và chuyển chúng cho cytochrome c, đi vòng qua phức hợp bị tổn thương.

Một trường hợp ghép cặp thứ hai sử dụng nguồn ATP hoàn toàn khác. Trong ty thể não phân lập có ATP synthase bị ức chế, xanh methylen vẫn kích thích hô hấp với mọi cơ chất được thử nghiệm. Tuy nhiên, tổng hợp ATP chỉ tăng với alpha ketoglutarate và glutamate, hai cơ chất tạo thành succinyl CoA. Khi oligomycin chặn ATP synthase, lượng ATP bổ sung đến từ quá trình phosphoryl hóa ở mức cơ chất do succinyl CoA ligase thực hiện trong chu trình axit citric, chứ không phải từ phosphoryl hóa oxy hóa. Chất màu cũng khôi phục điện thế màng khi phức hợp I và ATP synthase cùng bị ức chế. Ở đây, mức sử dụng oxy và ATP tăng cùng nhau, nhưng chỉ khi cơ chất cho phép con đường tạo ATP thứ hai hoạt động. Với succinate hoặc malate, hô hấp tăng mà không có thêm ATP. Cùng chất màu, cùng buồng đo, nhưng nhiên liệu khác thì kết quả khác.

Khi các chỉ tiêu tách biệt

Các trường hợp tách biệt cũng đã được công bố và mang lại những bài học không kém phần giá trị. Trong một nghiên cứu năm 1997 trên ty thể gan chuột cống phân lập, xanh methylen làm tăng tốc hô hấp trạng thái 4 ở ty thể ghép cặp chặt chẽ sử dụng succinate, khiến tỷ số kiểm soát hô hấp giảm. Hiệu ứng xuất hiện từ 0.5 micromolar và rõ rệt ở 5 micromolar, một nồng độ gần với mức trong huyết tương sau khi tiêm nhanh tĩnh mạch 100 milligram. Ở 5 micromolar, ty thể còn bị trương phồng, nhưng rối loạn ghép cặp đã xuất hiện trước ở các nồng độ thấp hơn. Điều này ủng hộ cách giải thích rằng rò rỉ xảy ra trước tổn thương cấu trúc, thay vì do tổn thương cấu trúc gây ra. Ở ty thể đã bị tách ghép, chất màu kích thích hô hấp theo cách phụ thuộc nồng độ và có thể đạt mức bão hòa. Mức sử dụng oxy tăng ở cả hai chế phẩm. Lượng ATP được tổng hợp trên mỗi lượng oxy tiêu thụ thì không tăng. Đó là sự tách ghép điển hình cùng với chuyển tải electron, diễn ra trong cùng một phân tử.

Sự tách biệt nổi bật nhất được ghi nhận ở võng mạc. Ở chuột nhắt thiếu AIF và tế bào cảm thụ ánh sáng được xử lý bằng rotenone, xanh methylen duy trì độ dày võng mạc, các dấu ấn tế bào cảm thụ ánh sáng và cấu trúc ty thể, đồng thời làm giảm tỷ lệ NADH trên NAD và giảm hoạt động của các con đường đáp ứng căng thẳng, bao gồm đáp ứng protein chưa gấp cuộn và tự thực bào ty thể. Những tác động này xảy ra mà không khắc phục sự thiếu hụt ATP. Sự bảo vệ không đi kèm khôi phục năng lượng có nghĩa là tác động có lợi diễn ra thông qua cân bằng oxy hóa-khử và tính toàn vẹn của ty thể, chứ không thông qua lượng ATP bổ sung. Bất cứ ai đồng nhất sự sống còn của mô với việc khôi phục sản lượng năng lượng đều sẽ hiểu sai hoàn toàn thí nghiệm đó.

Nghiên cứu trên ty thể não bổ sung một mặt đánh đổi vào cùng bức tranh. Chính những nồng độ thấp giúp cải thiện hoạt động năng lượng sinh học cũng làm tăng sự tạo thành hydrogen peroxide trong mọi điều kiện được thử nghiệm và làm chậm quá trình loại bỏ nó. Các phép đo sử dụng xét nghiệm Amplex đã được hiệu chuẩn thay vì một chất màu không đặc hiệu. ATP tăng và chất oxy hóa tăng đi đôi với nhau.

Danh sách kiểm tra khi đọc nghiên cứu

Bốn câu hỏi giúp phân biệt kết quả có ghép cặp với kết quả tách ghép.

Thứ nhất, chỉ tiêu nào thực sự được đo. Chỉ riêng mức tiêu thụ oxy không thể phản ánh ATP. Tổng hợp ATP, điện thế màng và tỷ số kiểm soát hô hấp mỗi chỉ tiêu bổ sung một phần thông tin mà điện cực oxy không thể ghi nhận. Hướng dẫn đọc các nhận định trong nghiên cứu xanh methylen trình bày chi tiết cách đọc chặt chẽ dựa trên các chỉ tiêu này.

Thứ hai, cơ chất nào được cung cấp cho ty thể. Kết quả liên quan đến succinyl CoA cho thấy việc lựa chọn nhiên liệu có thể quyết định liệu hô hấp tăng thêm có thể tạo ra ATP tăng thêm hay không.

Thứ ba, nồng độ nào được sử dụng. Xanh methylen ở nồng độ nanomolar đến micromolar thấp trong ty thể não đem lại cải thiện vừa phải về năng lượng sinh học, đi kèm sự gia tăng chất oxy hóa; từ nửa micromolar trở lên trong ty thể gan làm suy giảm sự ghép cặp; 5 micromolar còn gây trương phồng. Nồng độ là một phần của cơ chế, không phải chi tiết nền.

Thứ tư, kết quả được ghi nhận trên mô hình nào. Ty thể phân lập cho thấy cách các thành phần kết nối với nhau, nhưng tế bào và mô nguyên vẹn có thêm các quá trình vận chuyển, khử thành dạng không màu và các nơi tiếp nhận electron cạnh tranh. Nghiên cứu về lượng sử dụng trong phòng thí nghiệm, bao gồm cách nồng độ và quy trình định hình tác động của xanh methylen, là cầu nối giữa các con số trong buồng đo và bất kỳ nhận định nào về con người.

Mức tiêu thụ oxy phản ánh dòng electron. ATP phản ánh lượng năng lượng được thu giữ từ dòng đó. Xanh methylen có thể làm thay đổi một trong hai đại lượng, và các thí nghiệm trên cho thấy cả bốn tổ hợp kết quả: cả hai cùng tăng, hô hấp tăng nhưng ATP chỉ tăng khi cơ chất cho phép, hô hấp tăng trong khi sự ghép cặp giảm, và mô được bảo tồn trong khi ATP không đổi. Con số trên điện cực oxy là điểm khởi đầu của việc diễn giải, không phải điểm kết thúc.