Xanh methylen và Bartonella: kết quả phòng thí nghiệm và giới hạn của bằng chứng lâm sàng

Đĩa nuôi cấy và người bệnh cùng gắn với một từ, nhiễm trùng, nhưng không cùng một khái niệm. Trong đĩa, nhiễm trùng được thể hiện bằng số khuẩn lạc trên thạch. Ở người bệnh, đó là vi khuẩn bên trong tế bào và mạch máu, thuốc di chuyển qua máu và mô, cùng hệ miễn dịch đảm nhiệm một phần công việc. Nếu nhầm lẫn hai bối cảnh này, một con số ấn tượng trong phòng thí nghiệm sẽ bắt đầu có vẻ như một phương pháp điều trị. Nếu phân biệt rõ, con số ấy trở về đúng ý nghĩa của nó: một lý do để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.

Việc phân biệt đó chính là mục đích xuyên suốt của bài tổng quan này về xanh methylen và Bartonella. Hai nghiên cứu trong phòng thí nghiệm của cùng một nhóm nghiên cứu đã thử xanh methylen trên Bartonella henselae ở các trạng thái không tăng trưởng. Cả hai đều ghi nhận hoạt tính mạnh trong dụng cụ thủy tinh và nhựa. Không nghiên cứu nào thử trên người.

Vì sao các nhà nghiên cứu thử nghiệm ở pha tĩnh

Phần lớn thử nghiệm kháng sinh sử dụng tế bào đang tăng trưởng. Mô hình đó bỏ sót một trường hợp khó hơn: các tế bào đã ngừng phân chia và dung nạp được những thuốc vốn tiêu diệt các tế bào cùng loại đang tăng trưởng.

Bartonella có thể tồn tại dai dẳng trong cơ thể, kể cả bên trong hồng cầu và tế bào nội mô. Vì vậy, nhóm nghiên cứu đặt câu hỏi những thuốc đã được phê duyệt nào có thể tiêu diệt B. henselae sau khi vi khuẩn bước vào pha tĩnh. MIC thấp đối với tế bào đang tăng trưởng không dự đoán được khả năng tiêu diệt tế bào ở pha tĩnh. Rifampin có MIC rất thấp nhưng tiêu diệt tế bào ở pha tĩnh kém, trong khi những hợp chất có giá trị MIC cao hơn lại tiêu diệt chúng tốt. Độc giả muốn tìm một phương pháp chung để đọc dạng bài nghiên cứu này có thể tham khảo hướng dẫn đọc nghiên cứu về xanh methylen.

Đợt sàng lọc đầu tiên: Li và cộng sự, 2019

Đợt sàng lọc pha tĩnh năm 2019 trên Antibiotics sử dụng một chủng duy nhất, B. henselae JK53, được nuôi trong môi trường Schneider có 10 percent huyết thanh bào thai bò ở 37 C với 5 percent CO2. Các mẫu nuôi cấy một ngày chủ yếu gồm tế bào phân chia nằm rời rạc. Các mẫu nuôi cấy năm ngày, ở khoảng 10 mũ 8 đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mỗi mL, được xem là ở pha tĩnh và chứa các cụm kết tụ nhìn thấy được.

Phép thử sử dụng SYBR Green I cùng propidium iodide, được hiệu chuẩn bằng các hỗn hợp tế bào sống và tế bào đã bị tiêu diệt bằng isopropanol. Vì xanh methylen có màu đậm, các kết quả sàng lọc cho thấy hoạt tính được xác nhận bằng kính hiển vi, sau đó bằng số khuẩn lạc trên thạch máu, một tiêu chí đánh giá nghiêm ngặt hơn.

Trong 1,581 thuốc đã được phê duyệt được thử ở 50 micromolar, xanh methylen để lại tỷ lệ sống 16 percent theo máy đọc đĩa và 25 percent theo kính hiển vi. Daptomycin cho kết quả 21 percent, một số azole từ 22 đến 27 percent, gentamicin 32 percent, erythromycin 66 percent, ciprofloxacin 74 percent. Pyrvinium pamoate có vẻ mạnh hơn theo máy đọc nhưng không thể đánh giá bằng kính hiển vi do huỳnh quang của chính hợp chất này.

Đối với B. henselae đang tăng trưởng, MIC của xanh methylen là 0.08 đến 0.16 micrograms per mL. Đối với tế bào ở pha tĩnh sau năm ngày nuôi cấy, tại 5 micrograms per mL, số khuẩn lạc giảm đến mức không phát hiện được sau một ngày tiếp xúc, tương đương daptomycin và pyrvinium pamoate ở các nồng độ được thử. Một thí nghiệm riêng theo dõi khả năng tiêu diệt theo thời gian sử dụng 10 micrograms per mL. Đây là các mức phơi nhiễm trong phòng thí nghiệm, không phải liều dùng, và bài báo cũng trình bày chúng như vậy. Giá trị nồng độ đỉnh trong huyết tương người gần 3.9 micrograms per mL được trích dẫn trong bài báo chỉ để cung cấp bối cảnh. Bài tổng quan về dược động học của xanh methylen giải thích vì sao không thể diễn giải một giá trị trong huyết tương thành một giá trị trong mô.

Bài báo nêu rõ hai giới hạn. Không có mô hình màng sinh học và không thử phối hợp xanh methylen. Các cụm kết tụ sau năm ngày là những cụm tế bào trong môi trường nuôi cấy lỏng ở pha tĩnh, không phải một thí nghiệm màng sinh học đã được xác nhận. Các tác giả kêu gọi nghiên cứu trên động vật, nghiên cứu phối hợp thuốc, nghiên cứu màng sinh học và thử nghiệm trên các loài Bartonella khác.

Phối hợp thuốc và tế bào có nguồn gốc từ màng sinh học: Zheng và cộng sự, 2020

Nghiên cứu tiếp nối năm 2020 trên BMC Microbiology giữ nguyên chủng và môi trường nhưng chuyển sang các mẫu nuôi cấy pha tĩnh sáu ngày, đồng thời bổ sung hai yếu tố còn thiếu trong bài báo đầu tiên: các phối hợp hai thuốc và mô hình tế bào có nguồn gốc từ màng sinh học.

Với các thuốc đơn lẻ ở cùng nồng độ 5 micrograms per mL trong 24 giờ, xanh methylen để lại 3.2 nhân 10 mũ 4 đơn vị hình thành khuẩn lạc trên mỗi mL, so với mẫu đối chứng gần 2.8 nhân 10 mũ 10. Ciprofloxacin, gentamicin và nitrofurantoin để lại ít khuẩn lạc hơn tại cùng thời điểm. Điều này khác với kết quả năm 2019, khi cùng mức nồng độ danh nghĩa không để lại khuẩn lạc có thể phát hiện sau một ngày. Tuổi mẫu nuôi cấy, mật độ và cách xử lý khác nhau, nên tác dụng tiêu diệt có thể lặp lại về chiều hướng nhưng không giống nhau về mức độ. Sự thay đổi giữa các lần thử này là một lý do để các bước kiểm tra tiêu chuẩn về an toàn và tương tác xem hiệu lực trong phòng thí nghiệm là vấn đề riêng biệt với tác dụng lâm sàng.

Sàng lọc phối hợp thuốc là phần được trích dẫn nhiều nhất. Mỗi thành phần đều được cố định ở 5 micrograms per mL. Cả azithromycin phối hợp xanh methylen và rifampin phối hợp xanh methylen đều không để lại khuẩn lạc pha tĩnh có thể phát hiện ở 24 giờ; cả hai phối hợp có ciprofloxacin cũng vậy. Chỉ bốn phối hợp đó đạt kết quả này trong số 25 phối hợp được thử. Không có phân tích hiệp đồng chính thức, nên thuật ngữ đúng là phối hợp có hoạt tính trong những điều kiện này, không phải hiệp đồng đã được chứng minh.

Thí nghiệm màng sinh học thử các tế bào thu hồi từ một màng sinh học non đã bị phá vỡ, không phải khả năng thâm nhập vào một màng sinh học trưởng thành còn nguyên vẹn. Các mẫu được nuôi cấy năm ngày, pha loãng vào đĩa nhiều giếng để nuôi thêm năm ngày, xác nhận bằng nhuộm tím tinh thể, rồi cạo thu tế bào trước khi cho tiếp xúc với thuốc. Ở 5 micrograms per mL, xanh methylen đơn độc làm số lượng giảm xuống 2.3 nhân 10 mũ 2 vào ngày 6, nằm trong nhóm thuốc đơn lẻ có kết quả tốt nhất, nhưng không bằng không. Cả hai phối hợp có xanh methylen đều đạt mức không vào ngày 6, tương tự cả hai phối hợp có ciprofloxacin.

Các tác giả chỉ ra những giới hạn mà một người đọc cẩn trọng cũng sẽ nhận thấy: màng sinh học non đã được cạo thu thay vì màng sinh học lâu ngày còn nguyên vẹn; một nồng độ thuận tiện cho tất cả các thuốc thay vì từng thuốc ở nồng độ đỉnh thực tế riêng; chỉ chọn một số phối hợp xoay quanh azithromycin hoặc rifampin; một chủng; không có động vật; không có người bệnh. Nghiên cứu ba thuốc về sau mới chỉ được đề xuất, chưa được báo cáo.

So sánh thiết kế nghiên cứu

Bảng này trình bày cô đọng thông điệp của bài viết. Mọi nội dung bên trái cột cuối đều là nghiên cứu nuôi cấy. Không có nội dung nào trong hai bài báo thuộc cột cuối.

Bartonella không phải Borrelia

Cả hai bài báo đều nhắc đến Borrelia burgdorferi, xoắn khuẩn gây bệnh Lyme, vì phép thử dùng thuốc nhuộm bắt nguồn từ nghiên cứu trước đó về Borrelia ở pha tĩnh trong cùng phòng thí nghiệm, nơi xanh methylen và daptomycin cũng được xác định là có hoạt tính qua sàng lọc. Lịch sử đó cung cấp bối cảnh hữu ích, đồng thời là một nguồn nhầm lẫn thường gặp.

Không thí nghiệm nào trong hai bài báo về Bartonella thử Borrelia song song với Bartonella. Vi sinh vật khác nhau, môi trường khác nhau, nồng độ khác nhau, và tác động giả định của xanh methylen lên màng ở Bartonella được nêu là suy đoán cần nghiên cứu thêm. Không nên suy rộng kết quả từ loài này sang loài khác, và cả hai bài báo đều không hỗ trợ những nhận định bao quát về ký sinh trùng. Vì lý do này, bài so sánh các tế bào tồn lưu của Borrelia và Bartonella phân biệt rõ hai nhóm tài liệu nghiên cứu.

Vì sao kết quả nuôi cấy không thể chuyển thành phác đồ

Việc quan tâm tìm kiếm một phác đồ xanh methylen cho Bartonella là điều dễ hiểu. Chính những bài báo này cho thấy vì sao nên xem cụm từ đó là dấu hiệu cần thận trọng, chứ không phải danh sách mua sắm.

Thứ nhất, 5 micrograms per mL trong một giếng nuôi cấy không phải là đơn thuốc. Con số đó không đi kèm dữ liệu về hấp thu, phân bố, gắn kết protein, thâm nhập nội bào hay khả năng dung nạp. Các tác giả chọn mức này như một giá trị trung bình gần đúng của nồng độ đỉnh các kháng sinh và cho biết nghiên cứu tương lai nên sử dụng từng thuốc ở mức thực tế riêng.

Thứ hai, không có khuẩn lạc nghĩa là không có khuẩn lạc trong những điều kiện cấy đĩa đó, không có nghĩa là mô đã vô khuẩn. Tế bào tồn lưu, vi khuẩn nội bào và giới hạn lấy mẫu đều nằm ngoài phạm vi của đĩa thạch.

Thứ ba, những phối hợp làm một giếng nuôi cấy không còn vi khuẩn có thể thất bại hoặc gây hại trong cơ thể. Azithromycin phối hợp xanh methylen và rifampin phối hợp xanh methylen là các cặp thuốc trong phòng thí nghiệm, ở các mức phơi nhiễm của phòng thí nghiệm. Khi chưa có dữ liệu dược động học trên động vật và dữ liệu có đối chứng trên người, không có cơ sở xác định liều, thời gian dùng hay tỷ lệ lợi ích–nguy cơ. Bất kỳ ai đang cân nhắc các lựa chọn đều nên trao đổi với bác sĩ và xem lại khi nào việc sử dụng xanh methylen cần được giám sát y tế trước khi rút ra kết luận từ dữ liệu trong đĩa nuôi cấy.

Kết luận giới hạn mà những bài báo này thực sự hỗ trợ là: xanh methylen có hoạt tính có thể lặp lại đối với B. henselae JK53 không tăng trưởng trong điều kiện in vitro, kể cả trong các phối hợp hai thuốc tại phòng thí nghiệm; những kết quả mạnh nhất về phối hợp thuốc và tế bào có nguồn gốc từ màng sinh học đến từ nghiên cứu năm 2020. Mọi vấn đề khác, kể cả việc hoạt tính đó có ý nghĩa đối với bệnh do Bartonella ở người hay không, vẫn chưa được thử nghiệm.