Thạch EMB so với thạch MacConkey: lựa chọn và diễn giải môi trường

Một sinh viên cấy ria cùng một mẫu nước lên hai đĩa. Trên một đĩa xuất hiện các khuẩn lạc sẫm màu có ánh kim xanh lục. Trên đĩa kia xuất hiện các khuẩn lạc hồng tươi với quầng mờ xung quanh. Cả hai đĩa đều được cấy từ cùng một ống, ủ cạnh nhau và đọc kết quả vào cùng một thời điểm. Sinh viên hỏi đĩa nào cho kết quả đúng.

Cả hai đĩa đều đúng. Chúng trả lời những câu hỏi khác nhau. Sự nhầm lẫn xuất hiện khi coi hai môi trường này là các phương pháp sàng lọc có thể thay thế cho nhau đối với vi khuẩn đường ruột. Chúng có chung một mục đích là chọn lọc các vi sinh vật đường ruột Gram âm và phân biệt vi khuẩn lên men lactose với vi khuẩn không lên men, nhưng thực hiện mục đích đó bằng thành phần hóa học và logic quan sát khác nhau. Khi nắm được hai nguyên lý nền tảng này, việc chọn đĩa và đọc khuẩn lạc trở nên đơn giản.

Câu trả lời ngắn gọn

Thạch EMB sử dụng hai thuốc nhuộm, eosin Y và methylene blue, đảm nhiệm đồng thời hai vai trò: ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương và kết tủa quanh các vi khuẩn tạo acid mạnh để hình thành khuẩn lạc sẫm màu, điển hình là ánh kim xanh lục của Escherichia coli. Thạch MacConkey tách riêng các chức năng: muối mật cùng crystal violet ức chế vi khuẩn Gram dương, lactose làm cơ chất cho quá trình lên men, còn neutral red biểu thị sự tạo acid bằng khuẩn lạc màu hồng hoặc đỏ. Nếu mục tiêu là minh họa giả định E. coli bằng một dấu hiệu thị giác nổi bật, EMB có lợi thế rõ ràng. Nếu mục tiêu là phân loại đơn giản vi khuẩn lên men lactose thành màu hồng và vi khuẩn không lên men thành không màu, đặc biệt trong quy trình xử lý mẫu phân hoặc nước tiểu, MacConkey thường dễ đọc hơn. Không môi trường nào có thể xác định vi sinh vật chỉ dựa vào màu sắc.

EMB: thuốc nhuộm vừa chọn lọc vừa chỉ thị

Nguyên lý của EMB kết hợp chức năng chọn lọc và chỉ thị trong cùng các phân tử. Quy trình thạch eosin methylene blue của ASM mô tả EMB vừa là môi trường chọn lọc vừa là môi trường phân biệt, trong đó cặp thuốc nhuộm ức chế nhiều vi khuẩn Gram dương, còn quá trình lên men lactose thúc đẩy sự hấp thu và kết tủa thuốc nhuộm. Công thức Levine tiêu chuẩn chứa peptone, lactose, phosphate, eosin Y, methylene blue và agar, như được liệt kê trong phương pháp FDA BAM dành cho thạch Levine EMB. Lưu ý rằng một số công thức EMB cũ có bổ sung sucrose cùng với lactose, trong khi Levine EMB chứa lactose nhưng không có sucrose, vì vậy cần ghi lại chính xác công thức mà phòng thí nghiệm đang sử dụng.

Đọc kết quả trên EMB nghĩa là quan sát hành vi của thuốc nhuộm. Quá trình lên men lactose mạnh tạo ra đủ acid để gây kết tủa thuốc nhuộm đáng kể, khiến E. coli có tâm khuẩn lạc xanh đen sẫm và, trong trường hợp điển hình, xuất hiện ánh kim xanh lục dưới ánh sáng phản xạ. Các vi khuẩn lên men yếu hơn như Enterobacter và Klebsiella thường phát triển thành khuẩn lạc nhầy màu hồng đến tím mà không có ánh kim đó. Các vi khuẩn không lên men như Salmonella, Shigella và Proteus thường hình thành khuẩn lạc không màu hoặc trong mờ vì chúng không tạo ra lượng acid đột ngột đủ để làm kết tủa thuốc nhuộm. Vi khuẩn Gram dương thường bị ức chế, mặc dù mức độ ức chế không tuyệt đối và thay đổi tùy chủng cũng như sản phẩm. Hóa học đầy đủ của quá trình pha chế thuốc nhuộm, bao gồm lý do methylene blue hoạt động như một thuốc nhuộm cation, thuộc về một thảo luận riêng về các công thức thuốc nhuộm; bối cảnh kính hiển vi tổng quát được trình bày trong bản đồ các phương pháp nhuộm. Bài viết này chỉ tập trung vào việc lựa chọn và đọc môi trường nuôi cấy.

Hình trên chỉ mang tính minh họa. Nó cho thấy logic thị giác có thể mong đợi: trên EMB có các khuẩn lạc sẫm có ánh kim, các dạng nhầy màu hồng và các dạng nhạt màu; trong khi MacConkey chủ yếu phân biệt các dạng màu hồng với các dạng nhạt màu. Hãy dùng hình này để học mô hình nhận biết, sau đó đối chiếu mọi kết luận với ảnh đối chứng và tờ hướng dẫn của đúng loại môi trường đang được sử dụng trên bàn xét nghiệm.

MacConkey: chức năng tách biệt, quy tắc quan sát đơn giản hơn

Nguyên lý của MacConkey phân công mỗi chức năng cho một thành phần riêng. Quy trình thạch MacConkey của ASM cũng mô tả môi trường này theo khung chọn lọc và phân biệt, còn phương pháp FDA BAM dành cho thạch MacConkey liệt kê các thành phần chức năng: peptone, lactose, muối mật, muối, neutral red, crystal violet và agar. Muối mật cùng crystal violet tạo tính chọn lọc chống lại vi khuẩn Gram dương. Lactose cung cấp cơ chất cho quá trình lên men. Neutral red đóng vai trò chất chỉ thị pH, chuyển sang màu hồng đến đỏ tại nơi hình thành acid, đôi khi kèm theo kết tủa mật quanh các vi khuẩn lên men mạnh.

Quy tắc đọc được thiết kế có chủ ý để đơn giản: màu hồng nghĩa là vi khuẩn lên men lactose, còn không màu hoặc nhạt màu nghĩa là vi khuẩn không lên men. E. coli có màu hồng đến đỏ, thường kèm quầng kết tủa mật. Klebsiella và Enterobacter có màu hồng và thường có dạng nhầy do có nang. Salmonella, Shigella, Proteus và nhiều trực khuẩn Gram âm khác có dạng không màu. Một lợi ích phụ đáng chú ý trong phòng thí nghiệm giảng dạy là muối mật thường làm giảm hiện tượng lan rộng của Proteus, nhờ đó dễ thu được khuẩn lạc riêng biệt trên MacConkey hơn so với môi trường không chọn lọc, mặc dù sự ức chế không tuyệt đối và vẫn có các lựa chọn không chứa muối khi việc kiểm soát hiện tượng lan rộng là ưu tiên.

Nguyên nhân ở cấp độ phân tử khiến các thuốc nhuộm hoạt động theo cách này liên quan đến điện tích và cấu trúc. Methylene blue là một thuốc nhuộm phenothiazine dạng cation; cấu trúc và tính chất của nó giải thích ái lực đối với các bề mặt vi khuẩn có tính acid, cũng chính là ái lực tham gia vào quá trình kết tủa trong các vùng acid trên EMB.

So sánh nhanh

Hãy đọc bảng như một quy trình ra quyết định. Khi bài thực hành cần sinh viên quan sát một phổ cường độ lên men với một điểm cuối nổi bật, EMB thể hiện điều đó rõ ràng. Khi bài thực hành cần phân loại nhị phân nhanh trước khi xác nhận bằng xét nghiệm sinh hóa, MacConkey phù hợp với mục tiêu đó.

Chọn môi trường cho từng loại mẫu

Đối với các bài thực hành với nước nhằm nhận biết giả định coliform phân hoặc E. coli, EMB hấp dẫn vì ánh kim có đặc điểm thị giác dễ nhận biết. MacConkey cũng hỗ trợ phân lập vi khuẩn đường ruột Gram âm và có lịch sử sử dụng trong kiểm tra nước, nhưng không môi trường nào thay thế được một phương pháp kiểm tra nước theo quy định, vốn có thể yêu cầu các môi trường như modified mTEC hoặc MI tùy phép thử. Hãy kiểm tra phương pháp mà phòng thí nghiệm của bạn bắt buộc phải tuân theo.

Đối với các bài phân lập kiểu mẫu phân nhằm tách vi khuẩn lên men khỏi vi khuẩn không lên men, MacConkey nhìn chung hữu ích hơn trong hai môi trường. Quy trình thực tế với mẫu phân để tìm Salmonella hoặc Shigella thường bổ sung các môi trường đường ruột chọn lọc hơn như XLD hoặc Hektoen enteric thay vì chỉ dựa vào MacConkey.

Đối với bài thực hành kiểu mẫu nước tiểu mô phỏng quy trình lâm sàng, hãy dùng MacConkey cùng với thạch máu. MacConkey cho phép phân loại Gram âm ban đầu, trong khi thạch máu phục hồi các vi sinh vật bị MacConkey ức chế. Cách kết hợp này thường xuất hiện trong các mô tả lâm sàng về thiết lập nuôi cấy nước tiểu.

Để giảng dạy thuần túy về nguyên lý, hãy dùng cả hai. EMB cho thấy cường độ lên men có ý nghĩa và một phân tử có thể đảm nhiệm hai vai trò. MacConkey minh họa thiết kế mô-đun: thành phần chọn lọc, cơ chất và chất chỉ thị được tách riêng. Sinh viên cấy ria một chủng E. coli đã biết, một chủng Klebsiella aerogenes đã biết và một chủng Salmonella đã biết cạnh nhau trên cả hai môi trường thường sẽ không còn nhầm lẫn giữa hai nguyên lý này.

Những lỗi đọc kết quả lặp lại mỗi học kỳ

Lỗi phổ biến nhất là định danh chỉ dựa vào màu sắc. Màu hồng trên MacConkey có thể là E. coli, Klebsiella, Enterobacter hoặc một vi khuẩn lên men khác. Không màu có thể là Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas hoặc một vi khuẩn không lên men khác. Màu sắc là một kiểu hình sàng lọc dùng để định hướng các bước xác nhận như nhuộm Gram, oxidase, bảng xét nghiệm sinh hóa hoặc định danh bằng thiết bị, chứ không phải tên loài.

Lỗi thứ hai là diễn giải quá mức khi không thấy ánh kim. Một số khuẩn lạc E. coli thực sự, đặc biệt là các khuẩn lạc riêng lẻ, tạo rất ít hoặc không tạo ánh kim trên EMB. Không có ánh kim không loại trừ E. coli, và có ánh kim cũng không chứng minh được đó là E. coli. Hãy coi ánh kim là một dấu hiệu giả định.

Lỗi thứ ba là so sánh các đĩa ở những thời điểm khác nhau. Các vi khuẩn lên men lactose chậm có thể chuyển sang màu hồng trên MacConkey sau thời gian ủ kéo dài, làm mờ ranh giới rõ ràng giữa nhóm lên men và không lên men. Hãy đọc kết quả vào thời điểm do phòng thí nghiệm quy định và ghi lại thời gian ủ cùng với kết quả.

Lỗi thứ tư là đọc sự phát triển hỗn hợp như thể chỉ có một vi sinh vật. Một khuẩn lạc màu hồng cạnh một khuẩn lạc không màu biểu thị hai kiểu hình, không phải một dạng trung gian. Hãy chọn các khuẩn lạc tách biệt rõ và xử lý từng kiểu hình thái riêng. Kết cấu nhầy tạo ra một bẫy tương tự: cả Klebsiella và Enterobacter đều có thể trông nhầy, vì vậy chỉ riêng nang không bao giờ đủ để xác định tên. Vi sinh vật trước đây được giảng dạy dưới tên Enterobacter aerogenes hiện được phân loại là Klebsiella aerogenes, điều này giải thích vì sao các bảng cũ và nhãn mới có vẻ không thống nhất.

Đối chứng và nguyên tắc kết luận

Trong mỗi buổi, hãy sử dụng đối chứng bằng ảnh hoặc đối chứng tươi: E. coli cho phản ứng lên men mạnh, Klebsiella aerogenes cho phản ứng lên men dạng nhầy nhưng không có ánh kim điển hình, một chủng Salmonella cho phản ứng không lên men và không màu, cùng Staphylococcus aureus để xác nhận khả năng ức chế vi khuẩn Gram dương của đúng sản phẩm đang sử dụng. Đối chiếu số hiệu chủng và tiêu chí chấp nhận với tờ hướng dẫn của nhà sản xuất, vì mức độ chọn lọc thay đổi theo hàm lượng mật, crystal violet và thuốc nhuộm.

Hãy nhớ một câu tại bàn xét nghiệm. EMB dùng thuốc nhuộm vừa để chọn lọc vừa để biểu thị kết quả, nhờ đó tạo tín hiệu E. coli nổi bật nhưng đòi hỏi cách đọc tinh tế hơn. MacConkey tách chức năng chọn lọc khỏi chức năng biểu thị, nhờ đó cho phép phân loại rõ ràng giữa màu hồng và màu nhạt nhưng cung cấp ít chi tiết hơn về mức độ lên men. Hãy chọn môi trường có nguyên lý phù hợp với câu hỏi, xác nhận màu sắc bằng các xét nghiệm thích hợp, và khi đó hai đĩa không còn cạnh tranh mà bổ trợ cho nhau.