Mikroskopiya uchun metilen ko‘kiga muqobillar: vazifaga qarab tanlang

Oddiy bakterial surtma uchun, maqsad hujayra shaklini ko‘rish bo‘lsa, kristall binafsha metilen ko‘kini almashtirishi mumkin. Tirik hujayralar uchun esa yaxshiroq muqobil umuman bo‘yoqsiz faza-kontrast usuli bo‘lishi mumkin. Tanlov siz amalga oshirishingiz kerak bo‘lgan kuzatuvga bog‘liq.

Faraz qiling, ikki kishi bir xil bakterial kulturani tekshirmoqda. Biri tayoqchasimon hujayralarni yumaloq hujayralardan ajratmoqchi. Ikkinchisi esa muolaja bakteriyalarni o‘ldirgan-o‘ldirmaganini bilmoqchi. Birinchi kishiga aniq tasvir beradigan bo‘yoq ikkinchi kishiga foydali javob bermasligi mumkin.

Muqobil tanlashdan oldin ushbu gapni to‘ldiring: “Men ___ ichida ___ ni kuzatishim kerak, va hujayralar tirik qolishi shart / shart emas.” Shu gap bo‘yoq bajarishi kerak bo‘lgan vazifani belgilaydi.

Namuna va savoldan boshlang

Avval hujayralar tirik qolishi kerakmi-yo‘qmi, shuni aniqlang, so‘ng kuzatishingiz kerak bo‘lgan xususiyatni belgilang:

• Hujayralar tirik qolishi kerak: harakat yoki shakl uchun bo‘yalmagan faza-kontrast yoki DIC usulini ko‘rib chiqing; yadro DNKsi uchun fluorescent Hoechst 33342 ni ko‘rib chiqing; membrana yaxlitligi uchun SYTO 9 va propidium iodide kabi validatsiyadan o‘tgan tahlilni tanlang.
• Hujayralar tirik qolishi shart emas: bakterial morfologiya uchun kristall binafsha bilan oddiy bo‘yash yoki nigrozin bilan negativ bo‘yashni ko‘rib chiqing; Gram reaksiyasi uchun to‘liq Gram-bo‘yash usulidan foydalaning; fiksatsiya qilingan hujayralardagi yadro DNKsi uchun DAPI fluorescensiyasini ko‘rib chiqing.

Har bir yo‘nalishning cheklovlarini taqqoslash uchun ushbu jadvaldan foydalaning. Bular mavjud protokoldagi flakonlarni o‘zaro almashtirish bo‘yicha ko‘rsatmalar emas, balki usul tanlovlaridir.

Oddiy surtma uchun usulni ehtiyotkorlik bilan almashtiring

Vazifa bakterial morfologiyani bir rangda ko‘rish bo‘lsa, kristall binafsha amaliy nomzod hisoblanadi. FDAning Bacteriological Analytical Manual qo‘llanmasida oddiy bo‘yash uchun mos bo‘lgan ikkita kristall binafsha formulatsiyasi keltirilgan. Hujjatlashtirilgan formulatsiya va uning tayyorlash usulidan foydalaning; faqat bo‘yoq nomining o‘zi ishlaydigan reaktiv tarkibini belgilamaydi.

Kristall binafsha Gram bo‘yashda ham qo‘llanadi, ammo bu kristall binafsha bilan oddiy bo‘yashni Gram bo‘yashga aylantirmaydi. ASM Gram-bo‘yash protokolida differensial natija kristall binafsha, yod, rangsizlantirish va qarshi bo‘yashning ketma-ket ta’siriga bog‘liq. Bu bosqichlarni tashlab yuborish tasvir orqali aniqlash mumkin bo‘lgan narsani o‘zgartiradi. Bu farq uchun oddiy bo‘yash va Gram bo‘yash maqolasiga qarang.

Nigrozin konturlarni ko‘rsatishning boshqa usulini taklif qiladi: u fonni qoraytiradi, bakterial hujayralar esa nisbatan och qoladi. Merckning nigrozin bo‘yicha ko‘rsatmalarida oddiy muqobillar ro‘yxatida e’tibordan chetda qolishi mumkin bo‘lgan muhim tafsilot bor. Unda ko‘rsatilgan ishchi formulatsiya formaldegidni o‘z ichiga oladi. Shuning uchun, hujayralarning o‘zi bo‘yalmagan ko‘rinsa ham, “negativ bo‘yash” degan so‘zlardan uning tirik hujayralarga mosligini xulosa qilib bo‘lmaydi. To‘liq formulatsiya va namunani tayyorlash usulini tekshiring.

Tirik namunalar uchun optikani o‘zgartirishni ko‘rib chiqing

Agar hujayralarning harakatlanishi yoki bo‘linishini kuzatmoqchi bo‘lsangiz, yana bir bo‘yoq qo‘shish kuzatuvni murakkablashtirishi mumkin. Nikon shaffof namunalardagi kontrast bo‘yicha qo‘llanmasida tushuntirganidek, faza-kontrast va differensial interferensiya kontrasti, ya’ni DIC, namunalarning optik xususiyatlaridagi farqlar orqali ularni ko‘rinadigan qiladi. Mikroskopda zarur komponentlar mavjud bo‘lsa, ular tirik, bo‘yalmagan hujayralarni ko‘rsatishi mumkin.

Bu tanlov preparatni bo‘yalmagan holda saqlaydi, ammo olinadigan axborotni o‘zgartiradi. Qaysi molekula kontrastni hosil qilganini bilmasdan turib, chegara yoki harakatni kuzatishingiz mumkin. Agar savol molekulaning joylashuvi haqida bo‘lsa, uning o‘rniga mos belgilash usulini tanlang.

Yadro DNKsi uchun Invitrogenning DAPI va Hoechst bo‘yoqlarini taqqoslashi DAPIning fiksatsiya qilingan hujayralarda keng qo‘llanishini va hujayraga yaxshiroq kira oladigan Hoechst 33342 ning tirik hujayralarni belgilashda afzal ko‘rilishini farqlaydi. Har ikkisi ham fluorescensiya uskunasini talab qiladi. Ularning hech biri rangli brightfield bo‘yog‘ining to‘g‘ridan-to‘g‘ri o‘rnini bosmaydi.

Bo‘yoq ta’siri va yoritishni eksperimental sharoit sifatida ko‘ring. Agar siz o‘lchayotgan narsa hujayralarning xatti-harakati bo‘lsa, bo‘yalgan va bo‘yalmagan preparatlarni taqqoslang.

Qizil hujayra avtomatik ravishda o‘lik hujayra degani emas

SYTO 9 va propidium iodide ko‘pincha bakterial membrana yaxlitligini baholash uchun birgalikda qo‘llanadi. BacLight qo‘llanmasi yaxlit membranalarni yashil bo‘yalish, shikastlangan membranalarni esa qizil bo‘yalish bilan bog‘laydi. Bu talqin muayyan namuna uchun validatsiya qilinishi kerak.

Rosenberg va hamkasblarining 2019-yildagi tadqiqoti muammoni ko‘rsatadi. Fosfat-buferlangan fiziologik eritmada shisha ustida o‘stirilgan 24 soatlik E. coli biofilmlarida hujayralarning taxminan 96% i in situ holatda propidium-iodide-musbat ko‘ringan. Shunga qaramay, mualliflar yig‘ib olingandan keyin 82% hujayra kultivatsiya qilinishi mumkinligini hisoblagan. Konfokal tasvirlarda qizil bo‘yalgan material ostida ichki qismi yashil bo‘lgan hujayralar ko‘ringan, bu esa chalg‘ituvchi signalda hujayradan tashqari nuklein kislotalar ishtirok etganini ko‘rsatadi.

Bu foizlar universal tuzatish koeffitsiyentini emas, tadqiqot preparatlarida olingan turli o‘lchovlarni tavsiflaydi. Amaliy xulosa — signalni nima hosil qilganini tekshirish. Biofilmda nuklein kislota bo‘yog‘i shikastlangan hujayralar ichidagi material bilan birga hujayralar tashqarisidagi materialni ham aniqlashi mumkin. Yashovchanlik bo‘yicha xulosa chiqarish uchun tadqiqotchilar kultivatsiya yoki metabolik faollik kabi qo‘shimcha o‘lchovlarni tavsiya qiladi va har bir usulning o‘z cheklovlari borligini tan oladi.

Muqobil aslida nimalardan tashkil topganini tekshiring

Muqobil bo‘yash usuli baribir metilen ko‘kini o‘z ichiga olishi mumkin. Giemsa bunga misol: Merck o‘z mahsulotini azure-eosin-methylene-blue eritmasi sifatida ta’riflaydi va u qon hamda suyak iligi surtmalarini o‘z ichiga olgan qo‘llanmalar uchun mo‘ljallangan. U boshqa namuna uchun boshqa usul bo‘lishi mumkin, ammo metilen ko‘kini istisno qilish talabini qondirmaydi.

Agar birikmani istisno qilish eksperimentning bir qismi bo‘lsa, tasvirlarni taqqoslashdan oldin reaktivning identifikatsiyasi va formulatsiyasini tekshiring. Methyl blue, methylene blue va o‘xshash nomli bo‘yoqlar bo‘yicha qo‘llanma nomlanishdagi farqlarni tushuntiradi.

Natijadan foydalanishdan oldin almashtirishni tekshiring

Yangi usul uchun reprezentativ namunalar va mos nazoratdan foydalanib kichik taqqoslash o‘tkazing. Imkon qadar mikroskop sozlamalarini taqqoslanadigan darajada bir xil saqlang. Yaxshiroq ko‘rinadigan tasvir shunchaki afzal ko‘rilmasdan, uning sababi tekshirilishi uchun reaktiv formulatsiyasi, namunani tayyorlash, ta’sir va tasvirlash sharoitlarini qayd eting.

Muvaffaqiyatni dastlabki savolga nisbatan baholang. Morfologiya uchun hujayra chegaralari va joylashuvi talqin qilinadigan darajada qolganini baholang. Yadroni belgilash uchun signal joylashuvi va fonni baholang. Yashovchanlik uchun jozibali rang ajralishidan tashqari dalil talab qiling. Metilen ko‘ki bilan bo‘yash va laboratoriya qo‘llanmalari bo‘yicha kengroq qo‘llanma kuzatuv va preparat tayyorlash qanday uyg‘unlashishini tushuntiradi.

Sizga kerak bo‘lgan o‘lchovni saqlab qoladigan muqobilni tanlang. Rang hosil bo‘lgan tasvirning faqat bitta xususiyatidir.