Metilen ko‘ki mitoxondrial III kompleksni chetlab o‘ta oladimi? Nega tadqiqotlar bir-biriga zid

Ikki laboratoriya metilen ko‘ki bloklangan mitoxondrial III kompleksni chetlab o‘ta oladimi, degan savolni tekshirdi. Biri yo‘q, deb javob berdi. Ikkinchisi ha, dedi. Ikkalasida ham ma’lumotlar bor edi.

Sichqon miyasi mitoxondriyalarida o‘tkazilgan birinchi tadqiqot bo‘yoq buni uddalay olmasligini aniqladi. Uch kemiruvchi turining miya mitoxondriyalarida o‘tkazilgan ikkinchi tadqiqot esa u buni qisman uddalay olishini ko‘rsatdi. Sichqon jigarida o‘tkazilgan uchinchi tadqiqot ham ko‘pincha shu mavzu yonida tilga olinadi, lekin u boshqa narsani tekshirgan. Uni o‘z o‘rnida talqin qilsangiz, chalkashlikning yarmi yo‘qoladi.

Bu yerda e’lon qilish mumkin bo‘lgan universal mexanizm yo‘q. Bloklovchilar, dozalar va o‘lchangan ko‘rsatkichlari turlicha bo‘lgan uchta tajriba bor. Avval sharoitlarni o‘qing. Xulosalar shundan kelib chiqadi.

Bu yerda chetlab o‘tish nimani anglatadi

Elektronlar zanjirga I kompleks orqali (NADH dan) yoki II kompleks orqali (suksinatdan) kiradi, III kompleks orqali sitoxrom c ga, keyin IV kompleks orqali kislorodga o‘tadi. Yo‘l davomida hosil bo‘lgan gradientdan hujayra ATP ishlab chiqarish uchun foydalanadi.

Chetlab o‘tish haqidagi da’vo metilen ko‘ki elektronlarni blokdan oldingi nuqtada qabul qilib, blokdan keyingi nuqtaga topshirishini anglatadi. Oksidlangan bo‘yoq NADH yoki zanjirning dastlabki tarkibiy qismlaridan elektron olib, leykometilen ko‘kiga aylanadi; qaytarilgan shakl esa ularni sitoxrom c ga yoki yana zanjirga uzatadi. Agar elektronlar blokdan keyingi nuqtaga uzatilsa, nafas olish va membrana potensiali qisman tiklanadi. Agar ular blok joyiga yoki undan oldingi nuqtaga uzatilsa, hech narsa tiklanmaydi.

III kompleksning bir xususiyati bu bahsning katta qismini belgilaydi. Kompleks ikkita ingibitor bog‘lanish joyiga ega Q sikli orqali ishlaydi. Antimitsin Qi joyiga bog‘lanadi. Miksotiazol Qo joyiga bog‘lanadi. Ulardan faqat bittasini qo‘llagan tadqiqot kompleksning faqat yarmini tekshirgan bo‘ladi.

Birinchi tadqiqot: sichqon miyasi mitoxondriyalarida chetlab o‘tish kuzatilmadi

Gureev va hamkasblari C57BL/6 sichqonlarining miya po‘stlog‘idan digitonin yordamida ajratilgan mitoxondriyalarni ishlatib, har ml uchun 0.1 mg oqsil konsentratsiyasida tekshirdi. Substratlar uch xil sharoitni qamrab oldi: har biri 5 mM bo‘lgan piruvat va malat, 2 mM glutamat bilan 10 mM suksinat hamda 10 mM L-prolin. Bloklovchilar 1 micromolar rotenon (I kompleks) va har ml uchun 1 microgram antimitsin (III kompleks) edi. Bo‘yoq dozalari 0.5, 1 va 2 micromolar bo‘lib, asosiy konsentratsiya 1 micromolar edi. Usullar va qayd etilgan egri chiziqlar FEBS Letters qisqa maqolasida keltirilgan.

I kompleksni chetlab o‘tish ishladi. Rotenon ADP bilan rag‘batlantirilgan nafas olishni daqiqasiga har mg uchun taxminan 121 nmol dan taxminan 2 nmol gacha kamaytirdi, 1 micromolar bo‘yoq esa uni taxminan 21 gacha tikladi. Membrana potensiali piruvat va malat bilan ham, L-prolin bilan ham tiklandi.

III kompleksni chetlab o‘tish ishlamadi. Antimitsin nafas olishni taxminan 16 gacha pasaytirdi, bo‘yoq esa uni faqat taxminan 20 gacha oshirdi. Bo‘yoq dozasi 5 micromolar gacha bo‘lganda ham hech bir substratda membrana potensiali tiklanmadi. Peroksid bo‘yicha ma’lumotlar ham shu yo‘nalishni ko‘rsatdi: bo‘yoqning o‘zi peroksid ajralishini daqiqasiga har mg uchun qariyb 76 pmol bo‘lgan bazal tezlikdan uch dozada taxminan 1170, 1460 va 1945 gacha oshirdi, biroq antimitsin bo‘yoq keltirib chiqargan bu signalni mos ravishda taxminan 25, 88 va 96 foizga kamaytirdi. Agar qaytarilgan bo‘yoq kislorod bilan bevosita reaksiyaga kirishganida, III kompleksning bloklanishi signalni bostirmasligi kerak edi. Mualliflar qaytarilgan bo‘yoq III kompleksning Qo joyida, antimitsin blokidan oldingi nuqtada oksidlanadi, degan xulosaga keldi. Qisqa aylanishni so‘z bilan ifodalasak: donorlardan bo‘yoqqa, bo‘yoqdan Qo ga, undan keyin odatiy yo‘l bo‘ylab. Rotenon bloki chetlab o‘tiladi. Antimitsin bloki esa yo‘q.

Ikkinchi tadqiqot: uch turda, ikkala ingibitor joyida ham qisman chetlab o‘tish

Svab va hamkasblari tajriba tuzilishini kengaytirdi. Sichqon, kalamush va dengiz cho‘chqasi miyasidan Percoll yordamida ajratilgan mitoxondriyalar xuddi shu har ml uchun 0.1 mg konsentratsiyada, har biri 5 mM bo‘lgan piruvat va malat yoki glutamat va malat bilan tekshirildi. Ular III kompleksning ikkita bloklovchisini qo‘lladi: 0.3 micromolar antimitsin A va 1 micromolar miksotiazol. Ko‘pchilik tahlillarda bo‘yoq 2 micromolar, sitoxrom c bilan ishlashda esa 0.5 edi. Bir xil protokollar bilan tekshirilgan uchala tur haqidagi ma’lumotlar ochiq foydalanishdagi maqolada keltirilgan.

Uchala turda ham ikkala blok qisman chetlab o‘tildi. Sichqon mitoxondriyalarida antimitsin nafas olishni bostirdi, bo‘yoq esa uni taxminan 60 foizga, daqiqasiga har mg uchun qariyb 37 nmol dan 59 nmol gacha oshirdi. Miksotiazol uni 88 foizga, taxminan 4.5 gacha bostirdi, bo‘yoq esa besh barobar, taxminan 23 gacha oshirdi. Har ikkala ingibitor ta’sirida ham membrana potensiali qisman qayta qutblandi; optik artefaktlarni istisno qilish uchun bu ikki bo‘yoq — safranin O va ratiometrik TMRM — yordamida o‘lchandi.

Bu maqolada elektronlarning uzatilishi bevosita ham tekshirildi; birinchi tadqiqotda bunday tekshiruv o‘tkazilmagan edi. Tashqaridan qo‘shilgan 25 micromolar atsetillangan sitoxrom c energiyalangan mitoxondriyalar tomonidan ingibitorlar borligida ham, yo‘qligida ham qaytarilmadi, ammo bo‘yoq qo‘shilishi ikkala holatda ham qaytarilishga olib keldi. Hujayrasiz buferda NADH va bo‘yoq sitoxrom c ni NADH miqdoriga mutanosib tezlikda qaytardi. Uzunroq o‘tishni so‘z bilan ifodalasak: qaytaruvchi ekvivalentlardan bo‘yoqqa, bo‘yoqdan bevosita sitoxrom c ga, IV kompleksdan kislorodga. Bu yo‘l III kompleksni butunlay chetlab o‘tadi, shuning uchun ikkala bloklovchini ham chetlab o‘tish mumkin.

Yana ikkita ko‘rsatkich shu talqinni qo‘llab-quvvatlaydi. Miksotiazol bilan ishlov berilgan mitoxondriyalarga bo‘yoq qo‘shilganda NAD(P)H fluoressensiyasi pasaydi; bu qaytaruvchi ekvivalentlar yangi yo‘l orqali sarflanganini anglatadi. Shuningdek, bo‘yoqning 660 nm dagi yutilishi ketma-ket qo‘shilgan har bir modda ta’sirini aks ettirdi, sentrifugalangan namunalar supernatantlari esa oksidlangan bo‘yoq energiyalangan mitoxondriyalar ichida yuz barobardan ko‘proq to‘planishini, potensial qulaganda esa tashqariga chiqishini ko‘rsatdi. Protonlar hisobi ham bunga mos keladi: protonlarni haydash bosqichlarini o‘tkazib yuborish har bir elektron juftiga 10 o‘rniga taxminan 2 proton qoldiradi. Shu sababli kisloroddan tezroq foydalanish bilan birga faqat qisman qayta qutblanish kuzatilishi haqiqiy chetlab o‘tishga xos holatdir, unga qarshi dalil emas.

Xuddi shu preparatda yuzaki talqin qilishga yo‘l qo‘ymaydigan javoblar ham kuzatildi. Ingibitor va bo‘yoq birga bo‘lganda ADP nafas olishni oshirish o‘rniga pasaytirdi, transportning bloklanishi esa uni sekinlashtirish o‘rniga rag‘batlantirdi; shu bilan birga membrana potensiali odatiy yo‘nalishlarda o‘zgarishda davom etdi. Bu tizimda faqat kislorod iste’moliga qarash chalg‘itadi.

Uchinchi tadqiqot: III emas, I va II komplekslarni tekshirgan jigar tadqiqoti

Lee va Boelsterli sichqon jigari mitoxondriyalari hamda efavirenz (I kompleks, IC50 taxminan 30 micromolar) va izoniazid metaboliti bo‘lgan gidrazin (II kompleks, IC50 taxminan 30 micromolar) bilan shikastlangan, kulturada o‘stirilgan gepatotsitlardan foydalandi. Taxminan 30 micromolar bo‘yoq NADH oksidlanishi, membrana potensiali va ATP ni tikladi, shu bilan birga oksidlovchilar va nekrotik o‘limni kamaytirdi. Redox Biology maqolasi buni bo‘yoq elektronlarni shikastlangan I va II komplekslarni chetlab olib o‘tishi sifatida modellashtiradi.

Bu natija zanjirning oldingi qismiga oid tasdiqlangan kontekstdir. U III kompleks haqida hech narsa demaydi, chunki tajribada o‘sha joyda hech narsa bloklanmagan. U miya bo‘yicha ikki tadqiqotning birortasini ham tasdiqlay yoki rad eta olmaydi.

Sharoitlar matritsasi

III kompleks bo‘yicha ikkala tadqiqot ham o‘z sharoitida to‘g‘ri bo‘lishi mumkinligining to‘rt sababi

1. Bloklovchi ta’sir bir xil emas edi. Bir tomonda faqat har ml uchun 1 microgram antimitsin, ikkinchi tomonda esa 0.3 micromolar antimitsin va alohida Qo joyi bloklovchisi. Elektronlarni Qo joyiga uzatadigan bo‘yoq yo‘li aynan sitoxrom c ga bevosita uzatish yo‘li ishlaydigan sharoitda ishlamay qoladi. Bitta joy ikkala joyning o‘rnini bosa olmaydi.

2. Bo‘yoq dozasi va vaqt farq qilgan. Asosiy konsentratsiyalar 1 va 2 micromolar edi; bu oksidlanish-qaytarilish siklida qatnashadigan moddaning mitoxondriyaga kirishi hamda sitoxrom c ni bevosita qaytarishi konsentratsiya va vaqtga bog‘liq. Dozadagi kichik farqlar va ko‘rsatkichlarni turli vaqtda o‘lchash bir tarmoqning turli yo‘llarini namoyon qilishi mumkin.

3. Preparatlar farq qilgan. Digitonin bilan ajratish va Percoll gradientida ajratish bir-biriga qisman mos, ammo aynan bir xil bo‘lmagan mitoxondriya populyatsiyalarini tanlaydi. Oqsil konsentratsiyasi har ml uchun 0.1 mg da bir xil bo‘lgan, shu sababli bu o‘zgaruvchi omil chiqarib tashlanadi, ammo subpopulyatsiya va yaxlitlik bunday emas. Tur farqi haqidagi gumon ham rad etildi: ikkinchi guruh o‘z fenotipini sichqonda ham takrorladi.

4. Substrat holati bo‘yoq nima qila olishini belgilaydi. Bir tomonda uch xil substrat sharoiti, ikkinchi tomonda NADH bilan bog‘liq juftliklar. NADH ta’minoti va membrana potensiali birgalikda bo‘yoqning qanchalik tez qaytarilishini va qayerda taqsimlanishini belgilaydi. Qaytarilgan bo‘yoq oksidlangan sitoxrom c yonida bo‘lishini talab qiladigan yo‘l shu tanlovga qaramdir.

Chetlab o‘tish haqidagi navbatdagi da’voni qanday o‘qish kerak

Qaysi kompleks, qaysi ingibitor bilan, qaysi joyda va qanday dozada bloklanganini so‘rang. Bo‘yoq konsentratsiyasi va ko‘rsatkich qachon o‘lchanganini so‘rang. To‘qima, tur, ajratish usuli, oqsil konsentratsiyasi va substratni so‘rang. Shuningdek, potensial, nafas olish, oksidlanish-qaytarilish holati va bevosita elektron uzatish tahlili bir-biriga mos keladimi, deb so‘rang, chunki bu yerda faqat kislorod iste’moli bir necha bor noto‘g‘ri yo‘nalishni ko‘rsatgan.

Tor doiradagi xulosa o‘z kuchida qoladi. Bo‘yoqning I kompleksni chetlab o‘tishi borasida kelishuv mavjud. III kompleksga kelsak, har ml uchun 1 microgram antimitsin va 1 micromolar bo‘yoq bilan tekshirilgan sichqon mitoxondriyalarida funksional chetlab o‘tish kuzatilmaydi. Ammo 0.3 micromolar antimitsin yoki 1 micromolar miksotiazol va 2 micromolar bo‘yoq bilan tekshirilgan uch turda bo‘yoqdan sitoxrom c ga bevosita elektron uzatilishi bilan qisman chetlab o‘tish kuzatiladi. Bu jumlalar bir-biriga zid emas. Bundan kengroq har qanday xulosa ekstrapolyatsiyadir.

Mavzuga oid qo‘shimcha materiallar bahsli da’voni bahssiz kimyo doirasida ushlab turadi: elektron uzatilishi uchun metilen ko‘ki elektronlarni qanday ko‘chirishi, zanjirning oldingi qismiga oid tasdiqlangan holat uchun I kompleksni chetlab o‘tish tajribalari, nega ikkita bo‘yoq kerak bo‘lganini tushunish uchun membrana potensiali o‘lchovlari va ularning artefaktlari, doza va vaqt bilan bog‘liq xatolar uchun esa oksidlanish-qaytarilish siklida qatnashadigan moddalar bilan laboratoriyada ishlash masalalari.