Metilen ko‘ki va ferroptoz: temir, lipidlarning peroksidlanishi va hujayra o‘limi

Ferroptoz — membrananing shikastlanishi oqibatidagi hujayra o‘limi. Membranalardagi ko‘p to‘yinmagan yog‘lar zanjirli reaksiyada oksidlanadi, membrana o‘z vazifasini bajara olmay qoladi va hujayra nobud bo‘ladi. Bu kimyoviy jarayon uchun temir zarur. Shu jumla butun tushunchani ifodalaydi, ushbu maqoladagi barcha tajribalar esa uning muayyan qismini tekshiradi.

Bu yerda savol aniqroq: hujayralardagi tajribalarda metilen ko‘ki ushbu zanjirga qanday ta’sir qiladi va bu natija aslida nimani ko‘rsatadi? Qisqa javob shuki, ikkita laboratoriya tadqiqotida nanomolyar konsentratsiyadagi metilen ko‘ki mitoxondrial lipidlarning peroksidlanishini kamaytirgan va odatda ferroptozga olib keladigan qo‘zg‘atuvchilar ta’siridan keyin hujayralarni tirik saqlagan. Batafsil javob muhimroq, chunki zanjirning har bir bo‘g‘ini boshqa ta’sir vositasi bilan tekshirilgan va har bir ta’sirning o‘z cheklovlari bor.

Ferroptoz bir xatboshida

Ko‘p to‘yinmagan yog‘ kislotasi dumiga ega membrana fosfolipidining zaif nuqtasi bor: undan vodorod atomlarini tortib olish oson. Radikal ulardan birini tortib olgach, lipidga kislorod birikadi, lipid peroksil radikali hosil bo‘ladi va bu radikal keyingi lipiddan vodorodni tortib oladi. Biror narsa uni to‘xtatmasa, reaksiya membrana bo‘ylab davom etadi.

Asosiy to‘xtatuvchi vosita — GPX4 deb ataladigan ferment. U glutation yordamida lipid peroksidlarini zararsiz lipid spirtlarigacha qaytaradi. Laboratoriya qo‘zg‘atuvchilari bu himoyaning muayyan bo‘g‘inlariga ta’sir qiladi. Erastin xc-minus tizimi orqali sistin kirishini to‘sadi, natijada hujayrada glutation sintezi uchun sistein yetishmaydi. Butionin sulfoksimin glutation sintezini bevosita to‘sadi. RSL3 esa GPX4ning o‘zini ingibirlaydi. Uchala holatda ham peroksidlar bartaraf etilmay qoladi, ammo bu turli bosqichlarda yuz beradi. Shu sababli bitta qo‘zg‘atuvchi bilan olingan natijani boshqalariga avtomatik ravishda umumlashtirib bo‘lmaydi.

Ferroptoz uni belgilaydigan xususiyatlari bilan apoptozdan farq qiladi. Unda kaspaza kaskadi ham, apoptotik tanachalar ham bo‘lmaydi. Deferoksamin kabi temir xelatorlari va ferrostatin-1 kabi radikallarni tutuvchi moddalar uni bostiradi. Tadqiqotchilar hujayra o‘limini shunchaki nekrotik emas, ferroptotik deb atash uchun shu amaliy mezondan foydalanadi. Boshqariladigan hujayra o‘limi yo‘llarining kengroq manzarasi bu farqning o‘rnini tushunishga yordam beradi, hujayralarning labil temir bilan qanday ishlashi esa nima uchun xelatlash shu qadar hal qiluvchi nazorat ekanini izohlaydi.

Mitoxondriyalarning o‘rni va bu masala nega bahsli bo‘lgan

Dastlabki ishlarda mitoxondrial DNKsi yo‘q hujayralarda ham ferroptoz yuz berishi qayd etilgan. Bu mitoxondriyalar zarur emasligini anglatgandek ko‘ringan. Keyingi ishlarda esa mitoxondriyalar sonini kamaytirish yoki nafas olishni to‘sish sistein tanqisligi sababli yuzaga keladigan ferroptozni bostirishi, ammo GPX4ning bevosita ingibirlanishidan kelib chiqadigan ferroptozni bostirmasligi aniqlangan. Agar mitoxondriyalarning hissasi qo‘zg‘atuvchiga, hujayra turiga va hal qiluvchi peroksidlanish qayerda yuz berishiga bog‘liq bo‘lsa, ikkala natija ham to‘g‘ri bo‘lishi mumkin.

Ushbu maqolaga asos bo‘lgan tadqiqot bahsni muayyan hujayra bo‘limiga xos zond yordamida o‘rgangan. MitoCLox — lipidlar peroksidlanishi indikatorining mitoxondriyalarga yo‘naltirilgan turi: u mitoxondriya ichidagi lipid peroksil radikallariga duch kelganda fluoressensiyasini o‘zgartiradi. Erastin bilan ishlov berilgan fibroblastlarda mitoxondrial zondning oksidlanishi hujayralar hali tirikligida, o‘limdan oldin paydo bo‘lgan va hujayralar populyatsiyasi bo‘ylab bir xil bo‘lmagan. Bu vaqt ketma-ketligi muhim. O‘limdan oldin sodir bo‘ladigan peroksidlanish ehtimoliy sababdir. Faqat o‘lik hujayralarda o‘lchanadigan peroksidlanish esa qoldiq hodisadir. Lipidlar peroksidlanishini tekshirish usullari va har bir zond nimani ko‘rsatishi haqidagi qo‘shimcha qo‘llanmada zondning joylashuvi signalning ma’nosini nega belgilashi tushuntiriladi.

Xuddi shu holat ikkinchi modelda ham kuzatilgan. Leber irsiy optik neyropatiyasi bo‘lgan bemordan olingan, I kompleks mutatsiyasini tashuvchi va boshlang‘ich oksidlovchi stressi yuqoriroq fibroblastlar glutation kamaytirilganda ferroptoz orqali nobud bo‘lgan, nazorat fibroblastlari esa bunga chidagan. Mitoxondrial zondning oksidlanishi yana birinchi bo‘lib yuz bergan. Tafsilotlar ferroptozdagi mitoxondrial lipidlar peroksidlanishi bo‘yicha fibroblastlar tadqiqotida keltirilgan.

Ushbu tajribalarda metilen ko‘ki nimani o‘zgartirgan

Metilen ko‘ki — oksidlanish-qaytarilish tashuvchisi. Uning oksidlangan shakli I kompleksdagi NADH bilan bog‘liq kimyoviy jarayonlardan elektronlarni qabul qiladi, qaytarilgan shakli esa ularni IV kompleksga yetkazadigan sitoxrom c ga beradi. Bu elektronlar odatda kislorodga sizib o‘tib, superoksid hosil qiladigan zanjir qismi atrofida qisman aylanma yo‘l yaratadi. Elektronlar uzatilishining to‘liq manzarasini bilmoqchi bo‘lgan o‘quvchilar metilen ko‘ki elektronlarni mitoxondriyalar orqali qanday o‘tkazishi haqidagi maqoladan boshlashi kerak.

Erastin bilan ishlov berilgan o‘pka fibroblastlarida 250 nanomolar konsentratsiyadagi metilen ko‘ki, mitoxondriyalarga yo‘naltirilgan SkQ1 va MitoTEMPO antioksidantlari kabi, hujayralarning yashab qolishini baholash testida yashovchanlikni saqlagan. Nazorat tajribalari xulosaning chegaralarini belgilaydi. Ferrostatin-1, alfa-tokoferol va deferoksamin ham himoya qilgan, bu esa o‘lim ferroptotik bo‘lganini tasdiqlaydi. Antioksidant guruhi bo‘lmagan SkQ1 analogi himoya qilmagan. Bu nospetsifik to‘planishdan ko‘ra oksidlanish-qaytarilish kimyosining rolini ko‘rsatadi. SkQ1 konsentratsiyasi taxminan 200 nanomolar dan oshganda himoya susaygan. Bu xinon antioksidantlarining yuqoriroq miqdorlarda ma’lum bo‘lgan prooksidant xususiyatiga mos keladi. Metilen ko‘ki ham dozaga bog‘liq shunday ikki tomonlama xususiyatga ega: ushbu laboratoriya idishlarida past nanomolyar darajalarda himoya qiladi, ammo konsentratsiyasi oshirilganda yoki kuchli yoritilganda oksidlanish-qaytarilish sikli orqali vodorod peroksid hosil qilishi mumkin. Dozaga oid bunday sharoitlar mitoxondriyalardagi reaktiv kislorod shakllari haqidagi maqolada yoritilgan.

Keyin ajratib olingan mitoxondriyalardagi tajribalar ROS manbalarini farqlagan. Ikki valentli temir mavjud bo‘lganda, I kompleksga elektron yetkazuvchi substratlar va rotenon zond oksidlanishini kuchaytirgan. Rotenon flavin qismidan keyingi oqimni to‘sadi, shu sababli undan oldingi tashuvchilar qaytarilgan holatda qoladi va matriksga qaragan flavindan elektronlar kislorodga sizib o‘tadi. III kompleksga elektron yetkazuvchi substratlar va antimitsin A ko‘p miqdorda vodorod peroksid hosil qilgan, ammo lipidlar peroksidlanishini keltirib chiqarmagan. Umumiy ROS signali bir xil, joylashuv boshqa, natija boshqa. SkQ1 ham, metilen ko‘ki ham vodorod peroksid ishlab chiqarilishining o‘zini bostirmasdan, I kompleks sababli yuzaga kelgan peroksidlanishni bostirgan. Bu ularning ta’siri ROS hosil bo‘lishidan keyin, lipidlar peroksidlanishi bosqichida ekanini ko‘rsatadi.

Temirning ortiqcha yuklanishini o‘rganish va lipofussin bergan ishora

Ikkinchi tadqiqot bu savolni temir nuqtayi nazaridan o‘rgangan. Uch valentli temir ammoniy sitratining submillimolyar konsentratsiyasi ta’siriga uchragan H9c2 kardiomiotsitlarida mitoxondrial ROS, mitoxondrial lipidlar peroksidlanishi, so‘ng ferroptoz yuzaga kelgan. Shundan keyin 24 soat ichida lipofussinga o‘xshash pigment to‘plangan. Lipofussin — oksidlangan lipidlar va oqsillarning tarkibida temir bo‘lgan, o‘zidan fluoressensiya chiqaruvchi qoldig‘i bo‘lib, yosh o‘tishi bilan to‘planadi. Uning bu yerda tez paydo bo‘lishi temir keltirib chiqaradigan o‘tkir peroksidlanishni qarishning klassik belgisi bilan bog‘laydi. Nanomolyar konsentratsiyadagi metilen ko‘ki ham, SkQ1 ham peroksidlanishning, o‘limning va pigment to‘planishining oldini olgan. Ajratib olingan yurak mitoxondriyalari bu holatni tasdiqlagan: rotenon va ikki valentli temir peroksidlanish hamda pigmentga o‘xshash signalni yuzaga keltirgan, ikkala modda esa buni to‘sgan. To‘liq ketma-ketlik H9c2 kardiomiotsitlarida temirning ortiqcha yuklanishi bo‘yicha tadqiqotda bayon qilingan. Masalaning pigmentga oid tomoni lipofussin va hujayra qarishi belgilari bilan bog‘liq.

Hujayralarning yashab qolishini baholash testlari nimani ko‘rsatmaydi

CellTiterBlue kabi yashovchanlik testi qo‘zg‘atuvchi va ehtimoliy himoya qiluvchi modda ta’siridan keyin idishdagi qancha hujayra metabolik jihatdan faol qolganini ko‘rsatadi. Bu muayyan tizimda mexanizmni tekshirishdir. Bu davolash natijasi emas. Ushbu tajribalarning hech birida bemorga doza berilmagan, kasallikka oid yakuniy ko‘rsatkich o‘lchanmagan yoki organizmdagi terapevtik oraliq aniqlanmagan.

To‘rtta cheklovni aniq aytish kerak. Birinchidan, hujayra turlari doirasi tor: transformatsiyalangan o‘pka fibroblastlari, birlamchi teri fibroblastlari, jumladan mitoxondrial kasallikka ega bitta liniya, kalamush kardiomiotsitlari liniyasi hamda ajratib olingan kalamush yuragi mitoxondriyalari. Sezgirlik liniyaga qarab farq qilgan, LHON liniyasi esa tadqiqot rejasiga ko‘ra odatdagidan ancha zaif bo‘lgan. Ikkinchidan, qo‘zg‘atuvchilar laboratoriyadagi keskin sharoitlarni ifodalaydi: transport yoki sintezning to‘liq to‘silishi va hech bir to‘qima qisqa muddatda duch kelmaydigan temir yuklamalari. Uchinchidan, konsentratsiyani shunchaki ko‘paytirib, inson dozasiga aylantirib bo‘lmaydi. O‘stirish muhitidagi nanomolyar konsentratsiya inson dozasi emas. Laboratoriya idishi bilan inson organizmi o‘rtasida metilen ko‘kining taqsimlanishi, qon va to‘qimalarda rangsiz shakliga qaytarilishi, yorug‘lik ta’siri va membrana potensiali kabi omillar turadi. To‘rtinchidan, zondlar faqat o‘z bo‘limidagi holatni ko‘rsatadi. MitoCLox oksidlanishi mitoxondrial lipid radikallari hosil bo‘lganini ko‘rsatadi; u ehtimoliy yakuniy hodisa bo‘lgan plazmatik membrana yorilishining oldi avvalgi bosqichdagi ta’sir orqali emas, bevosita olinganini ko‘rsatmaydi.

Demak, asosli xulosa shuki: ushbu modellarda I kompleksdan kelib chiqadigan ROS va temir ferroptozdan oldin yuz beradigan mitoxondrial lipidlar peroksidlanishini keltirib chiqaradi, past konsentratsiyadagi metilen ko‘ki esa shu bo‘g‘inni uzadi. Bu bo‘g‘indan tashqaridagi har qanday xulosa uchun avval hayvonlarda, keyin esa odamlarda boshqa tajribalar zarur.