کیا میتھیلین بلیو مائٹوکانڈریا کے کمپلیکس III کو بائی پاس کر سکتا ہے؟ مطالعات میں اختلاف کیوں ہے

دو تجربہ گاہوں نے پوچھا کہ کیا میتھیلین بلیو مائٹوکانڈریا کے مسدود کمپلیکس III کو بائی پاس کر سکتا ہے۔ ایک نے جواب دیا: نہیں۔ دوسری نے کہا: ہاں۔ دونوں کے پاس اعداد و شمار تھے۔

پہلی تحقیق، جو چوہے کے دماغ کے مائٹوکانڈریا پر ہوئی، میں معلوم ہوا کہ یہ رنگ ایسا نہیں کر سکتا۔ دوسری تحقیق، جو کترنے والے جانوروں کی تین انواع کے دماغی مائٹوکانڈریا پر ہوئی، میں معلوم ہوا کہ یہ جزوی طور پر ایسا کر سکتا ہے۔ چوہے کے جگر پر ہونے والی ایک تیسری تحقیق کا ذکر بھی اکثر اسی بحث میں آتا ہے، مگر اس نے کسی اور چیز کو جانچا تھا۔ اسے اس کے درست سیاق میں رکھیں تو آدھی الجھن دور ہو جاتی ہے۔

یہاں کوئی ایسا عمومی طریقۂ کار نہیں جس کا اعلان کیا جا سکے۔ تین تجربات ہیں، جن میں رکاوٹ ڈالنے والے مادے، مقداریں اور پیمائشیں مختلف ہیں۔ پہلے حالات پڑھیں۔ نتائج ان کے بعد سمجھ آتے ہیں۔

یہاں بائی پاس سے کیا مراد ہے

الیکٹران کمپلیکس I کے ذریعے (NADH سے) یا کمپلیکس II کے ذریعے (سکسینیٹ سے) زنجیر میں داخل ہوتے ہیں، کمپلیکس III سے گزر کر سائٹوکروم c تک پہنچتے ہیں، اور پھر کمپلیکس IV سے ہوتے ہوئے آکسیجن تک جاتے ہیں۔ اس راستے میں بننے والے گریڈیئنٹ کو خلیہ ATP بنانے کے لیے استعمال کرتا ہے۔

بائی پاس کا دعویٰ یہ ہے کہ میتھیلین بلیو رکاوٹ سے پہلے الیکٹران وصول کرتا ہے اور انہیں رکاوٹ کے بعد پہنچا دیتا ہے۔ آکسیڈائزڈ رنگ NADH یا زنجیر کے ابتدائی اجزا سے الیکٹران لے کر لیوکومیتھیلین بلیو بن جاتا ہے، اور اس کی ریڈیوسڈ شکل انہیں سائٹوکروم c کو یا دوبارہ زنجیر میں منتقل کرتی ہے۔ اگر یہ منتقلی رکاوٹ کے بعد ہوتی ہے تو تنفس اور جھلی کا پوٹینشل جزوی طور پر بحال ہوتے ہیں۔ اگر یہ رکاوٹ کے مقام پر یا اس سے پہلے ہوتی ہے تو کوئی بحالی نہیں ہوتی۔

کمپلیکس III کی ایک تفصیل اس اختلاف کا بڑا حصہ طے کرتی ہے۔ یہ کمپلیکس دو انہیبیٹر مقامات کے ساتھ Q سائیکل چلاتا ہے۔ اینٹی مائسن Qi مقام سے جڑتا ہے۔ مائکسوتھیازول Qo مقام سے جڑتا ہے۔ ان میں سے صرف ایک استعمال کرنے والی تحقیق نے کمپلیکس کے صرف نصف حصے کو جانچا ہے۔

پہلی تحقیق: چوہے کے دماغی مائٹوکانڈریا میں کوئی بائی پاس نہیں

Gureev اور ساتھیوں نے C57BL/6 چوہوں کے دماغی قشر سے مائٹوکانڈریا لیے، انہیں ڈیجیٹونن سے الگ کیا، اور 0.1 mg پروٹین فی ml پر جانچا۔ سبسٹریٹس کی تین صورتیں تھیں: پائروویٹ اور میلیٹ، ہر ایک 5 mM؛ سکسینیٹ 10 mM کے ساتھ گلوٹامیٹ 2 mM؛ اور L-پرولین 10 mM۔ رکاوٹ ڈالنے والے مادے روٹینون 1 micromolar (کمپلیکس I) اور اینٹی مائسن 1 microgram فی ml (کمپلیکس III) تھے۔ رنگ کی مقداریں 0.5، 1 اور 2 micromolar تھیں، جبکہ بنیادی ارتکاز 1 micromolar تھا۔ طریقے اور ریکارڈ شدہ منحنیات FEBS Letters کی مختصر تحقیقی اشاعت میں موجود ہیں۔

کمپلیکس I کا بائی پاس کامیاب ہوا۔ روٹینون نے ADP سے تحریک یافتہ تنفس کو تقریباً 121 سے گھٹا کر تقریباً 2 nmol فی منٹ فی mg کر دیا، اور 1 micromolar رنگ نے اسے تقریباً 21 تک بحال کیا۔ پائروویٹ اور میلیٹ، نیز L-پرولین پر جھلی کا پوٹینشل بحال ہوا۔

کمپلیکس III کا بائی پاس نہیں ہوا۔ اینٹی مائسن نے تنفس تقریباً 16 تک گھٹا دیا، اور رنگ اسے صرف تقریباً 20 تک لے گیا۔ رنگ کی 5 micromolar تک مقداروں پر کسی بھی سبسٹریٹ کے ساتھ جھلی کا پوٹینشل بحال نہیں ہوا۔ پیرو آکسائیڈ کے اعداد و شمار نے بھی یہی اشارہ دیا: صرف رنگ نے پیرو آکسائیڈ کے اخراج کو تقریباً 76 pmol فی منٹ فی mg کی بنیادی شرح سے بڑھا کر تین مقداروں پر تقریباً 1170، 1460 اور 1945 کر دیا، مگر اینٹی مائسن نے رنگ سے پیدا ہونے والے اس سگنل کو بالترتیب تقریباً 25، 88 اور 96 فیصد کم کر دیا۔ اگر ریڈیوسڈ رنگ براہِ راست آکسیجن سے تعامل کرتا تو کمپلیکس III کو روکنے سے سگنل دبنا نہیں چاہیے تھا۔ مصنفین نے اخذ کیا کہ ریڈیوسڈ رنگ کمپلیکس III کے Qo مقام پر آکسیڈائز ہوتا ہے، جو اینٹی مائسن کی رکاوٹ سے پہلے ہے۔ الفاظ میں مختصر چکر یوں ہے: الیکٹران دینے والے اجزا سے رنگ تک، رنگ سے Qo تک، پھر آگے معمول کا راستہ۔ روٹینون بائی پاس ہو جاتا ہے۔ اینٹی مائسن نہیں۔

دوسری تحقیق: تین انواع میں، دونوں انہیبیٹر مقامات پر جزوی بائی پاس

Svab اور ساتھیوں نے تجرباتی خاکہ وسیع کیا۔ چوہوں، ریٹس اور گنی پگز کے دماغی مائٹوکانڈریا کو پرکول سے الگ کیا گیا اور اسی 0.1 mg فی ml پر جانچا گیا، جبکہ سبسٹریٹس پائروویٹ اور میلیٹ یا گلوٹامیٹ اور میلیٹ تھے، ہر ایک 5 mM۔ انہوں نے کمپلیکس III کو روکنے والے دو مادے استعمال کیے: اینٹی مائسن A، 0.3 micromolar، اور مائکسوتھیازول، 1 micromolar۔ زیادہ تر جانچوں میں رنگ 2 micromolar تھا، اور سائٹوکروم c کی جانچ میں 0.5۔ یکساں طریقۂ کار کے ساتھ تینوں انواع کی تفصیلات مفت دستیاب تحقیقی مقالے میں ہیں۔

تینوں انواع میں دونوں رکاوٹیں جزوی طور پر بائی پاس ہوئیں۔ چوہے کے مائٹوکانڈریا میں اینٹی مائسن نے تنفس دبایا اور رنگ نے اسے تقریباً 60 فیصد بڑھایا، یعنی تقریباً 37 سے 59 nmol فی منٹ فی mg تک۔ مائکسوتھیازول نے اسے 88 فیصد دبا کر تقریباً 4.5 کر دیا، اور رنگ نے اسے پانچ گنا بڑھا کر تقریباً 23 کر دیا۔ دونوں انہیبیٹرز کے تحت جھلی کا پوٹینشل جزوی طور پر دوبارہ قائم ہوا، جسے دو رنگوں (سیفرانن O اور نسبتی پیمائش والے TMRM) سے ناپا گیا تاکہ بصری پیمائش کی مصنوعی خرابیوں کو خارج کیا جا سکے۔

اس مقالے نے الیکٹران کی منتقلی کو براہِ راست بھی جانچا، جو پہلی تحقیق نے کبھی نہیں کیا تھا۔ باہر سے شامل کیا گیا ایسیٹائلیٹڈ سائٹوکروم c، 25 micromolar پر، توانائی یافتہ مائٹوکانڈریا سے ریڈیوس نہیں ہوا، چاہے انہیبیٹرز موجود تھے یا نہیں، مگر رنگ شامل کرنے سے دونوں صورتوں میں ریڈکشن ہوئی۔ خلیوں سے پاک بفر میں NADH اور رنگ نے سائٹوکروم c کو NADH کے تناسب سے ریڈیوس کیا۔ الفاظ میں یہ زیادہ لمبی چھلانگ یوں ہے: ریڈیوسنگ ایکویویلنٹس سے رنگ تک، رنگ سے براہِ راست سائٹوکروم c تک، کمپلیکس IV سے آکسیجن تک۔ یہ راستہ کمپلیکس III کو مکمل طور پر چھوڑ دیتا ہے، اس لیے دونوں رکاوٹیں بائی پاس ہو سکتی ہیں۔

دو اضافی پیمائشیں اس تشریح کی تائید کرتی ہیں۔ مائکسوتھیازول سے تعامل کرائے گئے مائٹوکانڈریا میں رنگ شامل کرنے پر NAD(P)H کی فلوروسینس کم ہوئی، یعنی ریڈیوسنگ ایکویویلنٹس نئے راستے سے نکل رہے تھے۔ اس کے علاوہ، 660 nm پر رنگ کی جذبیت نے ہر اضافے کو باری باری ظاہر کیا، جبکہ سینٹری فیوج کے بعد اوپر رہ جانے والے مائع نے دکھایا کہ آکسیڈائزڈ رنگ توانائی یافتہ مائٹوکانڈریا کے اندر سو گنا سے زیادہ جمع ہوا، پھر پوٹینشل ختم ہونے پر باہر نکل گیا۔ پروٹون کا حساب بھی اس سے مطابقت رکھتا ہے: پمپنگ کے مراحل چھوڑنے سے ہر الیکٹران جوڑے پر 10 کے بجائے تقریباً 2 پروٹون رہ جاتے ہیں، اس لیے آکسیجن کا تیز استعمال مگر صرف جزوی دوبارہ پولرائزیشن حقیقی بائی پاس کی صورت ہے، اس کے خلاف ثبوت نہیں۔

اسی تیاری نے ایسے ردعمل بھی پیدا کیے جو سرسری پڑھنے والے کو غلط نتیجے تک پہنچا سکتے ہیں۔ انہیبیٹر اور رنگ کی موجودگی میں ADP نے تنفس بڑھانے کے بجائے گھٹایا، اور نقل و حمل کی بندش نے اسے سست کرنے کے بجائے تحریک دی، جبکہ جھلی کا پوٹینشل پھر بھی معمول کی سمتوں میں بدلا۔ اس نظام میں صرف آکسیجن کا استعمال گمراہ کرتا ہے۔

تیسری تحقیق: جگر کی تحقیق جس نے کمپلیکس I اور II کو جانچا، III کو نہیں

Lee اور Boelsterli نے چوہے کے جگر کے مائٹوکانڈریا اور کلچر کیے گئے جگر کے خلیے استعمال کیے، جنہیں ایفاویرینز (کمپلیکس I، IC50 تقریباً 30 micromolar) اور آئسونیازڈ کے میٹابولائٹ ہائیڈرازین (کمپلیکس II، IC50 تقریباً 30 micromolar) سے نقصان پہنچایا گیا تھا۔ تقریباً 30 micromolar رنگ نے NADH کی آکسیڈیشن، جھلی کے پوٹینشل اور ATP کو بحال کیا، جبکہ آکسیڈنٹس اور نیکروسس سے خلیاتی موت کو کم کیا۔ Redox Biology کا مقالہ اس کی تشریح یوں کرتا ہے کہ رنگ الیکٹران کو متاثرہ کمپلیکس I اور II کے گرد سے گزار کر لے جاتا ہے۔

یہ نتیجہ زنجیر کے ابتدائی حصے کے بارے میں ایک تسلیم شدہ سیاق فراہم کرتا ہے، مگر کمپلیکس III کے بارے میں کچھ نہیں کہتا، کیونکہ وہاں کسی چیز کو روکا ہی نہیں گیا تھا۔ یہ دماغ کی دونوں تحقیقات میں سے کسی کی تصدیق یا تردید نہیں کر سکتا۔

حالات کا تقابلی جدول

چار وجوہ جن کی بنا پر کمپلیکس III کی دونوں تحقیقات اپنے اپنے تجرباتی حالات میں درست ہو سکتی ہیں

1. رکاوٹ ڈالنے کا طریقہ ایک جیسا نہیں تھا۔ ایک طرف صرف اینٹی مائسن 1 microgram فی ml تھا، جبکہ دوسری طرف اینٹی مائسن 0.3 micromolar اور Qo مقام کو روکنے والا ایک الگ مادہ تھا۔ رنگ کا وہ راستہ جو الیکٹران Qo مقام تک پہنچاتا ہے، عین وہاں ناکام ہوتا ہے جہاں براہِ راست سائٹوکروم c تک جانے والا راستہ کامیاب ہوتا ہے۔ ایک مقام دونوں کی نمائندگی نہیں کر سکتا۔

2. رنگ کی مقدار اور وقت مختلف تھے۔ بنیادی ارتکاز 1 کے مقابلے میں 2 micromolar تھے، اور یہ ایک ریڈوکس چکر چلانے والا مادہ ہے جس کا جذب اور سائٹوکروم c کی براہِ راست ریڈکشن ارتکاز اور وقت پر منحصر ہیں۔ مقدار کے چھوٹے فرق اور پیمائش کے مختلف اوقات ایک ہی نیٹ ورک کے مختلف راستوں کو نمایاں کر سکتے ہیں۔

3. تیاریاں مختلف تھیں۔ ڈیجیٹونن سے علیحدگی کے مقابلے میں پرکول گریڈیئنٹ سے علیحدگی مائٹوکانڈریا کی ایسی آبادیوں کو منتخب کرتی ہے جن میں کچھ اشتراک تو ہوتا ہے، مگر وہ بالکل یکساں نہیں ہوتیں۔ پروٹین کا ارتکاز دونوں میں 0.1 mg فی ml تھا، اس لیے وہ متغیر وجہ نہیں رہتا، مگر ذیلی آبادی اور ساختی سالمیت کے فرق باقی رہتے ہیں۔ نوع کے فرق کا شبہ بھی دور ہوا: دوسرے گروپ نے چوہے میں بھی اپنا مشاہدہ دہرایا۔

4. سبسٹریٹ کی حالت طے کرتی ہے کہ رنگ کیا کر سکتا ہے۔ ایک طرف سبسٹریٹس کی تین صورتیں تھیں اور دوسری طرف NADH سے منسلک جوڑے۔ NADH کی فراہمی اور جھلی کا پوٹینشل مل کر طے کرتے ہیں کہ رنگ کتنی تیزی سے ریڈیوس ہوتا ہے اور کہاں تقسیم ہوتا ہے، اور جس راستے کو آکسیڈائزڈ سائٹوکروم c کے قریب ریڈیوسڈ رنگ درکار ہو، وہ اسی انتخاب کا پابند ہوتا ہے۔

بائی پاس کے اگلے دعوے کو کیسے پڑھیں

پوچھیں کہ کون سا کمپلیکس روکا گیا، کس انہیبیٹر سے، کس مقام پر اور کس مقدار میں۔ رنگ کا ارتکاز پوچھیں اور یہ بھی کہ پیمائش کب لی گئی۔ بافت، نوع، علیحدگی کا طریقہ، پروٹین کا ارتکاز اور سبسٹریٹ پوچھیں۔ اور یہ پوچھیں کہ کیا پوٹینشل، تنفس، ریڈوکس حالت اور براہِ راست منتقلی کی جانچ ایک دوسرے سے متفق ہیں، کیونکہ یہاں صرف آکسیجن کے استعمال نے ایک سے زیادہ بار غلط سمت دکھائی۔

محدود خلاصہ برقرار رہتا ہے۔ رنگ کے ذریعے کمپلیکس I کا بائی پاس تسلیم شدہ ہے۔ کمپلیکس III کے معاملے میں، چوہے کے مائٹوکانڈریا میں اینٹی مائسن 1 microgram فی ml اور رنگ 1 micromolar پر کوئی فعلی بائی پاس نظر نہیں آتا، جبکہ تین انواع میں اینٹی مائسن 0.3 micromolar یا مائکسوتھیازول 1 micromolar اور رنگ 2 micromolar پر جزوی بائی پاس نظر آتا ہے، جس میں رنگ سے سائٹوکروم c کو براہِ راست منتقلی ہوتی ہے۔ یہ دونوں بیانات بیک وقت درست ہو سکتے ہیں۔ اس سے وسیع تر کوئی بھی دعویٰ ان نتائج سے آگے اخذ کیا گیا اندازہ ہے۔

متعلقہ مطالعہ متنازع دعوے کو غیر متنازع کیمیائی اصولوں کے دائرے میں رکھتا ہے: منتقلی کے سلسلے کے لیے میتھیلین بلیو الیکٹران کیسے منتقل کرتا ہے، زنجیر کے ابتدائی حصے کے تسلیم شدہ معاملے کے لیے کمپلیکس I کے بائی پاس کے تجربات، دو رنگوں کی ضرورت سمجھنے کے لیے جھلی کے پوٹینشل کی پیمائشیں اور ان کی مصنوعی خرابیاں، اور مقدار و وقت کی پیچیدگیوں کے لیے تجربہ گاہ میں ریڈوکس چکر چلانے والے مادوں کی ہینڈلنگ۔