Вимірювання активних форм кисню в експериментах із метиленовим синім

Дві лабораторії проводять те, що кожна називає експериментом з антиоксидантної дії метиленового синього. Одна повідомляє, що барвник пригнічує утворення активних форм кисню. Інша — що він їх утворює. Обидві демонструють чіткі криві залежності ефекту від дози. Обидві щирі. Причина розбіжності — не шахрайство й не некомпетентність. Просто дві групи вимірювали різні явища за різного освітлення, використовуючи зонди, які відповідають на різні запитання, а потім описали обидва результати одним терміном: АФК.

Метиленовий синій складно вимірювати точно, оскільки він бере участь у хімічних процесах, за якими має допомагати спостерігати. У темряві він переносить електрони між донорами й акцепторами та повертається до початкової форми, готовий до нового циклу. Під дією світла він стає фотосенсибілізатором, переходячи у збуджений триплетний стан, з якого може передавати енергію кисню з утворенням синглетного кисню або переносити електрони з утворенням радикалів і пероксиду водню. Будь-який зонд, доданий до такої системи, може окиснюватися, відновлюватися, знебарвлюватися або оптично маскуватися самим барвником. Тому перше запитання до будь-якого показника АФК — не про його числове значення. Треба з’ясувати, що саме виявляє метод і як барвник впливає на цей метод.

Amplex Red: калібрований метод визначення пероксиду водню

Поєднання метиленового синього й Amplex Red є найбільш обґрунтованим у цій літературі, якщо аналіз налаштовано правильно. Хімічна реакція специфічна: пероксидаза хрону використовує пероксид водню для окиснення субстрату Amplex до флуоресцентного продукту — резоруфіну — зі стехіометрією приблизно один до одного. Пероксид у зразку перетворюється на флуоресцентний сигнал у детекторі. Жодна інша сполука з класичної групи АФК безпосередньо не запускає цю реакцію.

Вирішальна перевага — калібрування. Ретельний дослідник аналізує стандарти з відомим вмістом пероксиду в тому самому буфері, з тими самими концентраціями пероксидази й субстрату, тим самим часом інкубації та тими самими оптичними налаштуваннями, а потім визначає показники зразків за отриманою кривою. У дослідженні ізольованих мітохондрій мозку, на якому ґрунтується цей метод, автори зробили саме так: наприкінці кожного вимірювання додавали відомі кількості пероксиду, а результати подали як швидкості в пікомолях за хвилину на міліграм білка, а не в умовних одиницях флуоресценції. Саме це перетворює світіння на вимірювання.

Три деталі цього дослідження варто відтворювати. По-перше, автори перевірили сигнал за допомогою каталази, яка руйнує пероксид. Після додавання каталази зростання флуоресценції, спричинене метиленовим синім, припинилося. Це підтвердило, що сигнал зумовлений пероксидом, а не оптичним артефактом. По-друге, вони безпосередньо перевірили вплив освітлення, перекриваючи промінь збудження затвором так, щоб зразки отримували одну восьму звичайної світлової дози, і сигнал зменшився лише на дев’ять відсотків. Понад дев’яносто відсотків визначеного ними пероксиду утворювалося незалежно від світла, використаного для вимірювання. По-третє, вони окремо виміряли усунення пероксиду за допомогою електрода й виявили, що барвник одночасно посилював його утворення та сповільнював видалення. Зонд, який показує лише підсумкову флуоресценцію, змішав би ці два ефекти.

Метод усе ж має слабкі місця, і метиленовий синій виявляє кілька з них. Барвник має широку смугу поглинання в тій самій червоній області, де випромінює резоруфін, тому за високих концентрацій барвника зразок може маскувати власний сигнал через ефекти внутрішнього фільтра. Отже, стандарти мають містити таку саму концентрацію барвника, як і зразки. Amplex Red також може самостійно фотоокиснюватися, а його продукт резоруфін — брати участь у фотоокисно-відновних циклах, що утворюють супероксид і пероксид. Це особливо важливо, коли в експерименті також освітлюють фотосенсибілізатор. Практичне рішення — спочатку опромінити зразки з метиленовим синім, а потім аналізувати аліквоти з реагентами Amplex у темряві, замість одночасного освітлення барвника й зонда. Нарешті, супероксиддисмутаза не просто пригнічує сигнал Amplex: перетворення супероксиду на пероксид може його підвищити. Контроль із SOD, у якому флуоресценція зростає, не є невдалим. Він виявляє супероксид як попередню ланку реакційного шляху.

DCFDA: неспецифічний індикатор окиснення

Поєднання метиленового синього й DCFDA є джерелом більшості непорозумінь. DCFH-DA — це попередник для введення зонда в клітини. Внутрішньоклітинні естерази відщеплюють його ацетатні групи, залишаючи нефлуоресцентний DCFH, а окиснення DCFH утворює флуоресцентний DCF. Перелік речовин, які його окиснюють, довгий: гідроксильні радикали, проміжні продукти пероксидазних і гемових реакцій, діоксид азоту, гіпохлоритна кислота та радикали, похідні пероксинітриту. Сам по собі пероксид водню не окиснює його безпосередньо зі швидкістю, придатною для вимірювання; флуоресценція, залежна від пероксиду, зазвичай потребує участі заліза, гемових білків або пероксидазних реакцій.

Критика, на яку варто посилатися в кожному розділі методів, походить з аналізу DCFH як зонда, виконаного Кальянараманом і колегами та узагальненого в дослідженні мітохондрій мозку, де з цієї причини відмовилися від DCFDA. Вони показали, що барвник реагує повільно, з неописаною стехіометрією, без належного калібрування та зі сполуками, які не належать до АФК. Зонд також підсилює те, що вимірює: одноелектронне окиснення DCFH утворює радикал DCF, який реагує з киснем з утворенням супероксиду, а той дисмутує з утворенням додаткового пероксиду. Саме вимірювання частково породжує хімічні процеси, про які повідомляє.

Усе це не робить DCFDA марним. Це робить його засобом скринінгу, а не ідентифікації. Зростання флуоресценції DCF означає посилення окиснення зонда, залежного від окисників. Воно не означає збільшення кількості пероксиду й тим більше не означає збільшення загальної кількості АФК — величини, якої не вимірює жоден окремий зонд. Ранні роботи з метиленовим синім, які спиралися на окиснення DCF за концентрацій понад один мікромоляр, повідомляли про прооксидантні ефекти, тоді як інші системи того самого періоду демонстрували захист від загибелі клітин, спричиненої пероксидом. Обидва спостереження можуть бути правильними для того самого барвника за різних окисно-відновних умов, а сам результат DCF не дає змоги встановити, який окисник зумовив сигнал. Важливість попередньої роботи з мітохондріями мозку полягає в тому, що вона замінила цей скринінг каліброваним вимірюванням пероксиду й безпосередньо виявила навантаження: навіть за концентрації барвника сто наномолярів вивільнення пероксиду зростало в кілька разів з усіма дослідженими субстратами та в усіх досліджених станах дихання.

DCFDA має ще одну пастку, специфічну для метиленового синього. Барвник інтенсивно забарвлений і окисно-відновно активний, тому може знебарвлювати флуоресцентний продукт, гасити випромінювання або окиснювати зонд незалежно від клітинних АФК. Безклітинний контроль із барвником і зондом, але без клітин — не необов’язкове доповнення. Саме цей експеримент показує, чи взаємодіє барвник із зондом.

Спінове уловлювання та поглинання кисню: ідентифікація й потік

Якщо флуоресцентні зонди повідомляють про появу чогось здатного до окиснення, то електронний спіновий резонанс зі спіновими пастками дає ближче уявлення про те, що саме з’явилося. У класичному дослідженні фотохімії метиленового синього використали ЕСР для виявлення аскорбатного радикала за наявності барвника, аскорбату та світла, а потім показали утворення пероксиду в експериментах із поглинання кисню та каталізоване залізом утворення гідроксильних радикалів у дослідах зі спіновим уловлюванням. Кожен метод відповідав на запитання, на які не могли відповісти інші: ЕСР встановлював природу радикала, поглинання кисню визначало потік реакції незалежно від будь-якого флуоресцентного зонда, а їх поєднання показало, що в тій самій освітленій системі діяли як синглетно-кисневі, так і радикальні шляхи.

Цей результат 1984 року й досі читається як попередження. За освітлення та наявності відновника барвник утворював пероксид, а за наявності заліза система продукувала гідроксильний радикал — найреактивнішу частинку в цій групі. Автори пов’язали це з аскорбатом в оці й поставили під сумнів необережне офтальмологічне застосування. Сучасним читачам варто звернути увагу на умови: світло плюс відновник плюс залізо. Якщо прибрати будь-який із цих чинників, шлях послаблюється або зникає.

Кисневі електроди заслуговують на своє місце з іншої причини. Електрод типу Кларка вимірює сумарне споживання кисню. Це підтверджує, що окисно-відновні процеси за участю барвника споживають молекулярний кисень, і дає кінетичні дані, які не може імітувати жоден флуоресцентний артефакт. Він не ідентифікує продукт. Утворення пероксиду, супероксиду, води та розпад синглетного кисню — усі ці процеси споживають кисень. Потік без ідентифікації так само неповний, як і ідентифікація без потоку, тому в переконливих роботах електрод поєднують із каліброваним визначенням пероксиду або пасткою.

Чому результати щодо антиоксидантної дії суперечать один одному

Якщо зіставити ці три типи вимірювань, видимі суперечності в літературі про метиленовий синій зводяться до відмінностей методів і трьох біологічних фактів.

По-перше, барвник одночасно є переносником електронів і джерелом пероксиду. Відводячи електрони від ділянок дихального ланцюга, де кисень інакше перетворився б на супероксид, він може знижувати кількість однієї АФК, тоді як його відновлена форма безпосередньо відновлює кисень до пероксиду, збільшуючи кількість іншої. Тому лабораторії, що досліджує мітохондріальні окисно-відновні процеси та обхідну роль барвника, слід очікувати відповідей, залежних від зонда: в тій самій кюветі показник, чутливий до супероксиду, знижується, а показник пероксиду зростає.

По-друге, пероксид у низьких дозах є сигналом, а не лише джерелом пошкодження. У дослідженні мітохондрій мозку мишей, яке продовжило попередню роботу, виявили утворення пероксиду вже за концентрації барвника п’ятдесят наномолярів без пошкоджень мітохондріальної ДНК за терапевтичних рівнів, а також захист від пошкоджень, спричинених ротеноном, після попередньої обробки. Лише за концентрації сто мікромолярів, значно вищої за терапевтичний діапазон, барвник пошкоджував окремі фрагменти ДНК, а червоне світло в поєднанні з концентрацією барвника двадцять мікромолярів спричиняло утворення синглетного кисню, який пошкоджував усі досліджені фрагменти. Запропонований механізм — горметичний: помірне утворення пероксиду запускає антиоксидантний захист, пов’язаний із Nrf2, та мітохондріальний біогенез, тому короткостроковий прооксидантний показник передує довгостроковому антиоксидантному результату. Показники, зняті через одну годину та через одну добу, можуть не збігатися, бо за цей час змінилися біологічні процеси.

По-третє, світло визначає навіть те, яка молекула присутня. Освітлення деметилює барвник з утворенням Azure B та споріднених продуктів, а лампи мікроскопа над чашкою достатньо для його фотосенсибілізації. Досліди в темряві та за освітлення — це різні досліди, і розділ будь-якого протоколу про контроль освітлення та поводження з барвником має враховувати цю відмінність.

Мінімальний набір контролів і правила оцінювання тверджень

Наведене нижче порівняння — оригінальний довідковий матеріал цієї статті. Перш ніж приймати будь-який результат щодо АФК у досліді з метиленовим синім, перевірте, які рядки автори заповнили, а які пропустили.

Звідси випливає практичне правило оцінювання. Калібрований аналіз Amplex із пероксидазою та перевіркою каталазою дає дані про пероксид. DCFDA дає дані про неспецифічне окиснення зонда — і нічого більше. Спінове уловлювання з контролями, що містять поглиначі радикалів, дає дані про природу радикалів. Поглинання кисню дає дані про потік. Речення, яке стверджує більше, ніж може підтвердити відповідний метод, хоч би як упевнено воно було написане, є реченням про зонд, а не про барвник. Пов’язані обговорення дозозалежності й горметичного діапазону, мітохондріального потоку електронів, інтерференції в аналізах забарвлених зразків та артефактів освітлення під час мікроскопії розширюють кожне з цих положень, і всі вони залишаються чинними після заміни відповідного тимчасового посилання.