Новий метиленовий синій і фарбування ретикулоцитів: окремий барвник і метод для живих клітин

Студент готується до підрахунку ретикулоцитів, замовляє метиленовий синій, змішує його з кров’ю — і майже нічого не бачить. Його однокурсник використовує флакон із написом «новий метиленовий синій» і отримує чіткі сині нитки всередині частини еритроцитів. Перший студент припускає, що вміст другого флакона свіжіший або концентрованіший. Ні те, ні інше. У ньому інша молекула.

Саме ця помилка в розумінні лежить в основі більшості непорозумінь у цій темі. Назва підказує, ніби новий метиленовий синій — це вдосконалена партія метиленового синього. Хімія свідчить про інше. Новий метиленовий синій N — окремий фенотіазиновий барвник із власним номером Colour Index, власною схемою заміщення та власною стандартизованою роллю в гематології. Коли ця відмінність зрозуміла, решта методу стає простою: чому під час фарбування клітини мають бути живими, що вважається ретикулоцитом, яке місце займають тільця Гайнца та коли використовують діамантовий крезиловий синій.

Коротка відповідь

Новий метиленовий синій N, гематологічний реагент, зазвичай ідентифікують як Basic Blue 24 у записі PubChem про новий метиленовий синій, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, формула C18H22ClN3S. Звичайний метиленовий синій — це метилтіонінію хлорид, Basic Blue 9, у відповідному записі PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, формула C16H18ClN3S. У структурі нового метиленового синього є дві метильні групи в кільці та етиламінні бічні ланцюги там, де метиленовий синій має диметиламінні групи. Ця відмінність змінює характер фарбування. У гематологічних посібниках звичайний метиленовий синій описують як відносно слабкий барвник для ретикулоцитів, а новий метиленовий синій — як такий, що дає інтенсивніше й рівномірніше забарвлення. Це порівняння узагальнено в тематичному огляді ScienceDirect про новий метиленовий синій.

Так, новий метиленовий синій — суправітальний барвник. Суправітальне фарбування означає фарбування живих клітин після їх вилучення з організму та до фіксації, як визначено в огляді NCBI щодо принципів суправітального фарбування. І новий метиленовий синій, і діамантовий крезиловий синій належать до цієї категорії, а стандарт CLSI щодо ретикулоцитів прямо розглядає новий метиленовий синій як суправітальний барвник. Студенти іноді відносять цей метод до фарбування фіксованих мазків за Романовським. Тут така уявна модель не працює. Якщо спочатку зафіксувати клітини, метод перестає працювати.

Для читачів, які розбираються зі схожими назвами барвників, стаття «Метиловий синій і метиленовий синій» пояснює іншу, ширшу плутанину між аніонним триарилметановим барвником і родиною катіонних фенотіазинових барвників. Огляд лабораторного фарбування розглядає суправітальні методи поряд із методами для фіксованих мазків, а посібник із морфології клітин крові показує місце оцінювання ретикулоцитів у ширшому диференційному аналізі.

Одне застереження щодо каталогів: існує окрема форма нового метиленового синього як подвійної солі з хлоридом цинку, CAS 6586-05-6. Тому в розділі методів слід указувати сольову форму й постачальника, а не лише загальну назву.

Що насправді відбувається під час суправітального фарбування

Ретикулоцит — це молодий еритроцит, який утратив ядро, але зберігає залишкову рибосомну РНК. У незабарвленому вологому препараті ця РНК невидима. Суправітальний барвник проникає в живу клітину й осаджує або агрегує цю РНК у сині гранули та нитки — сітчасто-нитчастий матеріал, видимий за олійної імерсії. Отже, ця сітка є продуктом фарбування, а не заздалегідь сформованим каркасом, який лише чекає на колір. Саме тому параметри протоколу — концентрація барвника, буфер, співвідношення крові та барвника, температура й час — мають не менше значення, ніж назва барвника.

Практичний наслідок — сувора послідовність дій: спочатку змішати кров з антикоагулянтом із барвником, інкубувати, потім приготувати мазки й дослідити їх без фіксації та контрастного дофарбовування. Фіксація до фарбування або контрастне дофарбовування, яке приховує слабко забарвлені нитки, знищує інформацію, від якої залежить підрахунок.

Робочий протокол дослідження ретикулоцитів із новим метиленовим синім

Єдиного універсального складу немає, тому слід зазначати використаний. Три задокументовані варіанти показують діапазон підходів.

У класичній процедурі типу Брешера використовують приблизно 0.5 відсотка нового метиленового синього з оксалатом калію, змішують у рівних об’ємах із добре перемішаною кров’ю з EDTA та інкубують приблизно 10–15 хвилин за кімнатної температури. Після обережного повторного перемішування готують тонкі клиноподібні мазки, висушують на повітрі та досліджують без фіксації під олійно-імерсійним об’єктивом 100x. Процедура підрахунку ретикулоцитів від NCBI описує цей робочий процес і рамку для підрахунку, яку в ньому використовують.

У варіанті Дейсі та Льюїса використовують 1.0 відсотка нового метиленового синього в цитратно-сольовому розчині, змішують із 2–4 об’ємами крові та витримують за 37 C протягом 15–20 хвилин перед приготуванням мазків. У нещодавньому впровадженні гармонізованої процедури CLSI H44 використовували менш концентрований 0.1-відсотковий розчин у фосфатно-буферному сольовому розчині з pH 7.4, з інкубацією за 20 C протягом 10 хвилин і без фіксації, як повідомлено в дослідженні гармонізації NMB 2026 року.

Правила підрахунку спільні для всіх варіантів. Зараховуйте клітину як ретикулоцит, якщо вона містить щонайменше дві окремі сині забарвлені гранули або сегменти ниток: це виключає поодинокі відкладення барвника. У рутинній роботі підраховуйте щонайменше 1,000 еритроцитів і подавайте кількість ретикулоцитів у відсотках. За низьких відсоткових значень статистика потребує більшої кількості клітин. В огляді методології CLSI H44 на De Gruyter зазначено, що за частки ретикулоцитів близько 1 відсотка потрібно приблизно 4,400 клітин, щоб знизити варіабельність підрахунку до 5 відсотків. Окулярний диск Міллера робить підрахунок великої кількості клітин практично здійсненним. Фільтруйте барвник або готуйте свіжий розчин, оскільки осад імітує гранулярні включення.

Тільця Гайнца в тому самому препараті

Той самий суправітально забарвлений мазок може також виявляти тільця Гайнца — агрегати окисненого й денатурованого гемоглобіну, а не залишкової РНК. У препаратах із новим метиленовим синім вони мають вигляд округлих тілець, часто поодиноких і розташованих біля мембрани, та забарвлюються у світліший синій колір, ніж сітчасто-нитчастий матеріал. Вони погано зберігаються після фіксації та контрастного дофарбовування, тому досліджуйте нефіксований мазок. У нещодавньому протоколі з використанням 20 мікролітрів крові з EDTA та 20 мікролітрів 1-відсоткового нового метиленового синього й інкубацією протягом 15 хвилин кількісно визначали клітини з тільцями Гайнца серед 250 еритроцитів; це описано в дослідженні PMC, де наведено цю процедуру.

Дві відмінності допомагають уникнути хибної інтерпретації. По-перше, метиловий фіолетовий і кристалічний фіолетовий забарвлюють тільця Гайнца інтенсивніше, ніж новий метиленовий синій, як зазначено в тематичному огляді ScienceDirect про тільця Гайнца. Новий метиленовий синій зручний, коли ретикулоцити й тільця Гайнца оцінюють одночасно, але він не є найінтенсивнішим спеціалізованим барвником для тілець Гайнца. По-друге, включення HbH за носійства альфа-таласемії після суправітального фарбування утворюють численні дрібні крапки по всій клітині, тоді як класичних тілець Гайнца менше, вони більші й часто пов’язані з мембраною. Третій імітатор — відкладення барвника: вони лежать поза фокальною площиною клітин і різняться між полями зору.

Діамантовий крезиловий синій порівняно з новим метиленовим синім

Обидва барвники використовують для суправітального фарбування ретикулоцитів, але стандартизація віддає перевагу одному з них. Метод дослідження ретикулоцитів CLSI H44-A2, розроблений спільно з Міжнародною радою зі стандартизації в гематології та наведений на сторінці стандарту CLSI H44, визначає фарбування крові з EDTA новим метиленовим синім як ручний порівняльний метод. Класичні гематологічні посібники узгоджуються щодо вигляду препаратів: новий метиленовий синій дає інтенсивніше й рівномірніше забарвлення ниток, тоді як діамантовий крезиловий синій має більшу варіабельність між партіями та зразками.

Цей статус потребує уточнення. Настанова ICSH з оцінювання аналізаторів визнає ручну мікроскопію з новим метиленовим синім як референсний порівняльний підхід, але називає її суб’єктивною та відносно неточною; за наявності перевагу віддають референсним процедурам проточної цитометрії. У порівнянні 100 зразків 2022 року виявили менше систематичне відхилення від результатів використаного аналізатора для діамантового крезилового синього, ніж для нового метиленового синього, про що повідомлено в порівнянні методів фарбування на PMC. Обґрунтований підсумок для студентів: використовуйте новий метиленовий синій як стандартизований барвник для ручного порівняльного методу, перевіряйте будь-який локальний метод із діамантовим крезиловим синім шляхом порівняння з ним або з автоматизованим методом і в обох випадках очікуйте більшого розкиду результатів ручної мікроскопії. У давнішій літературі зі стандартизації також рекомендували очищений Azure B як хімічно чистішу альтернативу через варіабельність комерційних партій барвників — зокрема в дослідженні Маршалла щодо Azure B. Це пояснює, чому ступінь чистоти реагенту досі обговорюють у контексті методів.

Як уникнути типових помилок

Чотири помилки спричиняють більшість невдалих препаратів. Замовлення звичайного метиленового синього замість нового метиленового синього N дає слабке фарбування через хімічні властивості, а не через техніку. Фіксація або контрастне дофарбовування перед оцінюванням усуває суправітальний сигнал. Підрахунок осаду барвника як гранул завищує результат; цьому запобігають правило двох гранул і фільтрування барвника. Підрахунок замалої кількості клітин за низького відсотка ретикулоцитів дає число, яке виглядає точним, але має широкі довірчі межі. У кожної помилки одна й та сама ознака: мікроскопіст звинувачує мікроскоп у тому, що було визначено ще на етапі роботи з реагентом.