Метиленовий синій і жирова хвороба печінки: що виявили експериментальні дослідження

Жирова хвороба печінки — одна назва для кількох різних проблем. В однієї людини причиною є тривале надмірне вживання алкоголю. В іншої — надлишкове надходження поживних речовин у поєднанні з інсулінорезистентністю та посиленим надходженням жиру до печінки. В обох випадках під мікроскопом може бути видно просте накопичення жиру, але першопричини різні. Саме ця різниця визначає, що може довести конкретний експеримент.

Наукових робіт про метиленовий синій і жирову хворобу печінки небагато, і всі вони щодо цього питання є доклінічними. Найчастіше цитують три дослідження на щурах і мишах, і їхні результати не узгоджуються між собою. В одному дослідженні з годуванням етанолом вдалося скоригувати окисно-відновне зрушення, але вміст жиру в печінці залишився незмінним. В одному дослідженні раціону з високим вмістом жирів кількість жиру в печінці зменшилася разом зі зміною сигнальних процесів. В одному дослідженні на здорових тваринах виявили протилежні зміни перекисного окиснення ліпідів у печінці та нирках. Разом ці роботи показують, чому слід розмежовувати три кінцеві показники: окисно-відновні зміни, активацію сигнальних шляхів і накопичення жиру в тканині.

Три кінцеві показники, які легко сплутати

Окисно-відновний показник описує перенесення електронів. Співвідношення NAD+ до NADH у печінці показує, чи є клітинне середовище відносно окисненим або відновленим. Окиснення етанолу перетворює NAD+ на NADH, тому хронічне вживання алкоголю знижує це співвідношення. Барвник, який приймає електрони, може знову його підвищити. Це хімічний процес, а не доказ зменшення запасів жиру.

Показник сигнальних процесів описує регуляцію. SIRT1 — це NAD+-залежний регуляторний фермент, який модифікує білки, залучені до роботи мітохондрій та обміну ліпідів. AMPK діє як сенсор низького рівня енергії: після активації він сприяє окисненню енергетичних субстратів і стримує синтез ліпідів. Коли стаття повідомляє про активацію SIRT1 у печінці під дією метиленового синього, йдеться про регуляторне зрушення. Це ще не повідомлення про результат для пацієнта.

Гістологічний або біохімічний показник описує саму печінку. Поширені приклади — вміст тригліцеридів на грам тканини, фарбування нейтрального жиру барвником Oil Red O, оцінка балонної дистрофії та ушкодження за допомогою фарбування гематоксиліном і еозином, а також активність ALT у плазмі. Лише ця третя категорія дає відповідь, чи зменшився стеатоз печінки під дією метиленового синього в конкретному експерименті.

Розмежування цих категорій запобігає найпоширенішому хибному тлумаченню: сприятливий окисно-відновний або сигнальний результат не означає зменшення жирового накопичення в печінці.

Етанолова модель: окисно-відновний стан скориговано, жир без змін

Найчіткіший негативний результат отримано в дослідженні тривалого годування етанолом самців щурів Wistar. Тварини отримували етанол у складі рідкого раціону, причому його частка зростала до 36 відсотків загальної енергетичної цінності. Контрольні тварини з попарно узгодженим споживанням корму отримували глюкозу замість енергії з етанолу. Одна етанолова група й одна контрольна група також отримували метиленовий синій у концентрації 130 mg на літр раціону, приблизно 42 mg на kg на добу, з дня 5 до дня 30.

Окисно-відновний стан оцінювали за стандартними парами метаболітів: співвідношенням лактату до пірувату для цитозолю та 3-гідроксибутирату до ацетоацетату для мітохондрій. На ранньому етапі годування високими дозами етанолу в етанолових групах спостерігали значні зрушення: співвідношення NAD+ до NADH у цитозолі знизилося приблизно на 62 відсотки, а в мітохондріях — приблизно на 71 відсоток; також підвищився рівень гліцерол-3-фосфату. Метиленовий синій значною мірою усував ці зрушення та відновлював рівень гліцерол-3-фосфату майже до контрольних значень, не змінюючи споживання етанолу, приросту маси тіла чи рівня етанолу в сироватці.

Вміст жиру в печінці показав іншу картину. На день 12, до значного накопичення жиру, вміст тригліцеридів між групами не відрізнявся. На день 27 в етанолових групах він суттєво зріс незалежно від метиленового синього. На день 30 загальний вміст ліпідів у тварин, яких годували етанолом, зріс приблизно на 89 відсотків, а тригліцеридів — приблизно на 196 відсотків; барвник знову не вплинув на ці зміни. Центрилобулярна жирова інфільтрація виглядала однаково з втручанням і без нього. Автори дійшли висновку, що спричинене етанолом окисно-відновне зрушення не є основною причиною жирового накопичення в печінці після тривалого годування в цій моделі. Тут корисно розуміти, як результати досліджень на тваринах і клітинах співвідносяться з ризиком для людини: механізм може бути реальним і водночас не визначати результат.

Саме це дослідження варто наводити, коли хтось стверджує, що будь-яка корекція окисно-відновного стану обов’язково усуває жир із печінки. У цьому експерименті такого не сталося.

Метаболічна модель: сигнальні зміни та менше жиру в мишей

Іншу картину показує дослідження на гепатоцитах і мишах із раціоном із високим вмістом жирів, зосереджене на SIRT1 та AMPK. У клітинах HepG2, клітинах AML-12 і первинних гепатоцитах щурів метиленовий синій підвищував співвідношення NAD+ до NADH, збільшував рівень білка SIRT1, зменшував ацетилювання регулятора PGC-1alpha, підвищував вміст мітохондріальної ДНК і споживання кисню та активував AMPK із подальшим підвищенням CPT-1 і PPARalpha. Коли експресію SIRT1 пригнічували, активація AMPK зникала, що пов’язує цей ланцюг із SIRT1 у зазначеній клітинній системі. Барвник також протидіяв ліпогенним сигналам від агоніста LXR T0901317 і впливу пальмітату, зокрема індукції SREBP-1c, FAS та ACC.

У тваринній частині дослідження використовували самців мишей C57BL/6, яких протягом 8 тижнів годували раціоном із 60 відсотками жиру. Протягом останніх 4 тижнів метиленовий синій вводили перорально чотири рази на тиждень у дозах 3 або 10 mg на kg на добу. У мишей, які отримували речовину, спостерігали менш виражене фарбування Oil Red O, нижчий вміст тригліцеридів у печінці, меншу балонну дистрофію та жирову дегенерацію за гістологічними даними, а також нижчий рівень ALT у плазмі порівняно з мишами на тому самому раціоні без втручання. Фармакокінетична частина тієї самої роботи показала пероральну біодоступність приблизно від 31 до 35 відсотків за майже повного всмоктування в кишківнику, але значного метаболізму. Найвище співвідношення концентрації в тканині до концентрації в плазмі спостерігали в печінці, що принаймні з погляду розподілу робить вплив на печінку правдоподібним.

Це справді сигнал зменшення стеатозу, але межі його застосовності вузькі. Йдеться про короткий експеримент на мишах із 9–10 тваринами в групі, одним раціоном, двома дозами та чотирма тижнями втручання. У ньому вивчали метаболічний стеатоз і ознаки стеатогепатиту, а не захворювання, пов’язане з алкоголем; також не перевіряли вплив на цироз, зворотний розвиток фіброзу чи будь-які результати в людей. Роль мітохондріальних та окисно-відновних показників у тлумаченні таких результатів — підтримувати гіпотезу, а не слугувати підставою для дози чи протоколу.

Зріз здорових тканин: однакова доза, протилежні зміни в органах

Третє дослідження часто залучають до тверджень про печінку там, де це недоречно. У 30-денному експерименті на здорових самицях щурів Wistar п’ять тварин отримували 1 mM метиленового синього з питною водою, а п’ять були контрольною групою. Рівні супероксиддисмутази, каталази та відновленого глутатіону в печінці й нирках не змінилися. Перекисне окиснення ліпідів дещо посилилося в печінці та зменшилося в нирках. Рівні ALT і креатиніну в сироватці знизилися, а рівень азоту сечовини в крові не змінився.

Коректне тлумачення — тканинна специфічність у здорових тварин, а не лікування захворювання. За одним показником однаковий вплив виглядав слабко прооксидантним у печінці та слабко захисним у нирках, тоді як стандартні показники антиоксидантного захисту залишалися незмінними. За наявності лише п’яти тварин у групі та відсутності моделі захворювання ця робота застерігає від визначення метиленового синього як універсального антиоксиданту для печінки. Вона також показує, чому зміни печінкових ферментів потребують чітко визначеного контексту захворювання, перш ніж їх можна вважати поліпшенням.

Порівняння трьох експериментів на печінці

Таблиця наочно показує головне: подібний синій барвник, різна біологія. Етанолове дослідження відокремлює успішну корекцію окисно-відновного стану від відсутності змін жиру. Дослідження раціону поєднує сигнальні зміни та зменшення жиру в одній моделі. Дослідження на здорових тваринах показує, що окисно-відновні маркери можуть змінюватися в протилежних напрямках залежно від органа.

Чому з цього не випливають твердження про лікування

Жодне з цих досліджень не залучало людей із жировою хворобою печінки. Дози, шляхи введення та тривалість відрізняються між роботами, і їх не можна перетворити на схему для людини простим масштабуванням. Малі розміри груп, особливо три тварини на кожну часову точку оцінки окисно-відновного стану в етаноловому дослідженні та п’ять на групу в дослідженні здорових тварин, залишають значну невизначеність. Відрізняються стать, лінія тварин, склад раціону та час початку втручання відносно ушкодження. До того ж дві моделі захворювання відображають різні першопричини, тому позитивний результат дослідження раціону не може компенсувати негативний результат етанолового дослідження, і навпаки.

Для людини з діагностованим захворюванням печінки нагальніше ознайомитися із застереженнями, а не з потенційними лікувальними застосуваннями. Огляд застережень щодо метиленового синього при порушеннях функції нирок і печінки пояснює, чому порушення функції органів змінює питання безпеки, навіть коли результати дослідження на тваринах виглядають сприятливими. Надайте лікарю діагноз, останні результати аналізів, точну інформацію про продукт і шлях введення та повний список ліків і запитайте, які докази підтримують застосування цього продукту з цією метою в людини з таким ступенем порушення функції органа.

Підсумок: метиленовий синій змінив окисно-відновний стан печінки в одній етаноловій моделі, не зменшивши накопичений жир; активував SIRT1 і AMPK та одночасно зменшив кількість жиру в одній метаболічній моделі на мишах; а у здорових щурів виявив органоспецифічні окисно-відновні ефекти. Це сукупність напрямів для подальших досліджень, а не встановлений метод лікування жирової хвороби печінки.