Вимірювання впливу метиленового синього на мітохондрії: кисень, ATP і мембранний потенціал

Припустімо, лабораторія додає метиленовий синій до мітохондрій із порушеним диханням і спостерігає зростання споживання кисню. Природно було б написати, що барвник відновив функцію мітохондрій. Але це твердження може бути хибним. Потік кисню, синтез ATP і мембранний потенціал — три різні поняття. Вони стосуються однієї органели так само, як резервне копіювання, синхронізація та спільний доступ стосуються однієї хмарної папки: вони пов’язані, але підпорядковуються різним правилам. Якщо сплутати одне з іншим, інтерпретація буде хибною, навіть коли кожне вимірювання технічно правильне.

Метиленовий синій сприяє такій плутанині, бо сам бере участь у системі, яку допомагає вимірювати. Він циклічно проходить окисно-відновні перетворення, приймаючи електрони на попередніх ділянках і віддаючи їх на наступних; є ліпофільним катіоном, що накопичується в енергізованих мітохондріях; а також інтенсивно синьою сполукою, яка поглинає та випромінює світло в тих самих спектральних діапазонах, що й поширені зонди. Один показник не може врахувати все це. Надійний підхід, продемонстрований у будапештських дослідженнях мітохондрій, — вимірювати потік кисню разом зі швидкістю синтезу ATP, мембранним потенціалом і виділенням пероксиду водню, застосовуючи на кожному етапі контролі, специфічні для барвника.

Респірометрія вимірює потік кисню, а не вироблення енергії

Респірометрія високої роздільної здатності, чи то за допомогою Oroboros Oxygraph, чи аналізатора позаклітинних потоків Seahorse, показує лише одне: як швидко відновлюється кисень. Вона не показує, скільки протонів було перекачано на кожен електрон, яку частку градієнта було збережено чи чи використала його ATP-синтаза.

Термінологія має значення. В ізольованих мітохондріях субстрат без ADP дає дихання, пов’язане з витоком протонів, субстрат із насичувальною концентрацією ADP — здатність до окисного фосфорилювання, а титрування роз’єднувачем — максимальну здатність до перенесення електронів. В інтактних клітинах відповідними показниками Seahorse є базальне дихання, чутливе до олігоміцину дихання, пов’язане із синтезом ATP, витік протонів, максимальне дихання, визначене за допомогою FCCP, і немітохондріальне споживання кисню, стійке до ротенону та антиміцину. Називати показники Seahorse станами 3 і 4 означає приписувати їм точність, якої такий препарат не забезпечує, що чітко пояснює методична схема Agilent Mito Stress Test.

Метиленовий синій порушує інтуїтивний зв’язок між більшим споживанням кисню та більшим виробленням енергії. В ізольованих мітохондріях мозку морської свинки барвник у концентраціях від 100 nM до 1 uM підвищував споживання кисню у стані спокою із субстратами глутаматом разом із малатом, сукцинатом і альфа-гліцерофосфатом; на альфа-гліцерофосфаті зростання становило приблизно 64 відсотки. Водночас стимульоване ADP дихання здорових мітохондрій практично не змінювалося, згідно з дослідженням ізольованих мітохондрій мозку. Оскільки дихання, пов’язане з витоком, зростало, а стимульований ADP потік залишався незмінним, розрахований коефіцієнт дихального контролю знижувався. Це зниження не означає, що барвник пошкодив мітохондрії. Воно означає, що барвник додав до нормального дихання окисно-відновний цикл, який споживає кисень. Аналіз споживання кисню за участю метиленового синього, який повідомляє лише про зростання, вимірює реальний хімічний процес, але нічого не говорить про збереження енергії.

Експерименти з відновлення функції демонструють той самий розрив у більшому масштабі. За заблокованого комплексу I потік кисню відновлювався приблизно втричі, тоді як синтез ATP — лише приблизно в 1.5 раза. До електрода доходило більше кисню. Менша його частка забезпечувала синтез ATP. Будь-яке твердження про поліпшення окисного фосфорилювання потребує даних щодо ATP, бажано у вигляді відношення ATP до кисню із зазначенням того, як визначено знаменник.

Аналізи ATP вимірюють швидкість синтезу, яку не можна замінити вмістом

Аналіз ATP відповідає на інше запитання: скільки ATP утворюється за одиницю часу. Кінетичне вимірювання — люмінесценція люциферази світляка, яку відстежують протягом кількох хвилин, або спряжений аналіз із гексокіназою та глюкозо-6-фосфатдегідрогеназою з реєстрацією при 340 nm — дає швидкість. Одноразове вимірювання загального ATP у кінцевій точці дає його вміст, який відображає різницю між синтезом і споживанням та сам по собі мало говорить про окисне фосфорилювання.

Будапештська група застосувала спряжений ферментативний метод із пригніченням аденілаткінази й виявила, що метиленовий синій у концентраціях від 1 до 2 uM помірно, але статистично значуще підвищував вироблення ATP у мітохондріях, оброблених ротеноном і антиміцином. Це справжнє відновлення, але часткове. Дослідження токсичності TEGDMA дало подібний результат в іншій моделі: стоматологічний мономер TEGDMA у концентрації 5 mM різко знижував дихання, пов’язане з комплексом I, приблизно з 286 до 28 одиниць потоку, а 2 uM барвника відновлювали його приблизно до 86.

Для забарвленої редокс-активної сполуки два контролі є обов’язковими. По-перше, проведіть дослід з олігоміцином, щоб визначити, яка частка виміряного синтезу ATP залежить від ATP-синтази. По-друге, у безклітинній системі перевірте відновлення сигналу після додавання відомої кількості ATP, використовуючи повний набір реагентів і ті самі концентрації барвника, що й у досліді, щонайменше 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM і 2 uM. Барвник може поглинати випромінюване світло, пригнічувати репортерний фермент або змінювати окисно-відновну хімію реагентів, а загальні рекомендації щодо люциферазних аналізів радять біохімічні контрольні тести саме для такого типу інтерференції. Не припускайте, що за 1 uM артефактів немає лише тому, що гасіння зазвичай сильніше за вищих концентрацій.

Зонди мембранного потенціалу вимірюють розподіл барвника, а не потік

Сафранін O, TMRM і TMRE, родамін 123 та JC-1 — це катіони, здатні проникати крізь мембрани. Вони накопичуються в негативно зарядженому матриксі відповідно до електрохімічної рівноваги, тому сумарна флуоресценція опосередковано відображає потенціал через розташування зонда. Жоден із них не вимірює ATP чи потік електронів.

Для кожного зонда є оптимальний тип препарату. Сафранін O підходить для ізольованих мітохондрій і пермеабілізованих клітин, зазвичай у концентрації близько 2 uM, зі збудженням поблизу 495 nm і випромінюванням поблизу 585 nm, у режимі гасіння, коли поглинання зонда змінює сумарну флуоресценцію. TMRM і TMRE підходять для інтактних клітин за низького наномолярного завантаження в режимі без гасіння, коли деполяризація спричиняє вихід барвника й зниження мітохондріальної флуоресценції; за високого завантаження напрям зміни сигналу може інвертуватися через самогасіння. JC-1 дає зручне відношення зеленого сигналу до червоного, але залежить від завантаження та мітохондріальної маси, тому для кількісної роботи поступається ретельно контрольованому TMRM. Ці компроміси узагальнено в широко використовуваному огляді зондів мітохондріального мембранного потенціалу.

Метиленовий синій створює оптичну інтерференцію саме за робочих концентрацій. Його смуги поглинання поблизу 600–665 nm перекриваються з червоним випромінюванням зондів, тому ефекти внутрішнього фільтра, гасіння та поглинання збуджувального світла цілком можливі. Барвник також є другим ліпофільним катіоном, власний розподіл якого змінюється разом із вимірюваним потенціалом. Захист від цього — додаткові незалежні вимірювання та холості проби: лише зонд, лише барвник, зонд із кожною концентрацією барвника, повна деполяризація за допомогою FCCP як нульова точка відліку та, в ідеалі, другий зонд з іншими оптичними характеристиками. Дослідження обходу комплексу III створило такий прецедент: відновлення мембранного потенціалу після інгібування антиміцином і міксотіазолом перевірили і сафраніном O, і TMRM та отримали однакове за характером відновлення. Один оптичний репортер — це підказка. Два незалежні репортери — це доказ.

Три препарати, три різні запитання

Ізольовані мітохондрії, пермеабілізовані клітини та інтактні клітини — не взаємозамінні налаштування чутливості одного аналізу. Це різні підходи з різними принципами роботи.

Ізольовані мітохондрії зберігають ланцюг перенесення електронів, внутрішню мембрану та молекулярний апарат матриксу, але позбавлені плазматичної мембрани, цитозолю та мережевої архітектури. Саме це усунення і є метою: субстрати, ADP, інгібітори та концентрації барвника задані точно, тож можна визначити залучений шлях. Ціною є втрата природного постачання субстратів, сигналізації та потреби в енергії.

У пермеабілізованих клітинах мітохондрії залишаються всередині значною мірою збереженої клітинної архітектури, а екзогенні субстрати та ADP проходять крізь відкриту плазматичну мембрану. Це належний інструмент для визначення дефекту субстратного шляху в клітинному контексті. Надмірна пермеабілізація пошкоджує зовнішню мембрану, а цитозольні регуляторні компоненти вимиваються.

Інтактні клітини зберігають усе: бар’єр плазматичної мембрани, цитозольні відновники, транспорт ендогенних субстратів, мітохондріальну мережу та потребу в ATP. Вони найближчі до фізіології й найдалі від з’ясування механізму, оскільки поглинання, відновлення та секвестрація барвника разом визначають його фактичну дію на мітохондрії.

У дослідженні TEGDMA свідомо використали всі три рівні: ізольовані мітохондрії мозку — для вивчення відновлення окиснення та потенціалу барвником, пермеабілізовані стовбурові клітини пульпи зуба — переважно для локалізації порушення в окисненні субстратів, пов’язаному з комплексом I, а інтактні стовбурові клітини — для оцінки сумарного фізіологічного впливу 2 uM барвника на пригнічене споживання кисню. Для читачів, які порівнюють мітохондріальні показники між різними препаратами, супровідна стаття про те, як метиленовий синій переносить електрони через дихальний ланцюг, пояснює відповідні шляхи, а посібник із читання досліджень дихання за участю метиленового синього розглядає логіку вибору доз та інгібіторів.

Контролі, яких потребує редокс-активний барвник

Сполуці, що циклічно проходить окисно-відновні перетворення, потрібен довший перелік контролів, ніж звичайному інгібітору, оскільки хімічні реакції самого барвника можуть імітувати біологічні процеси.

Для респірометрії використовуйте камеру лише з буфером для оцінки дрейфу, камеру з буфером і барвником без біологічного матеріалу, барвник із кожним позаклітинним відновником, наявним в аналізі, а також кінцеве додавання ротенону й антиміцину для визначення немітохондріального споживання кисню в інтактних клітинах. Зверніть увагу, що відновлений барвник повторно окиснюється, передаючи електрони кисню з утворенням пероксиду водню. Тому холоста проба лише з барвником без донора електронів недооцінює безклітинне споживання кисню, яке виникає за наявності NADH або NADPH.

Для пероксиду водню віддавайте перевагу каліброваній системі Amplex UltraRed із пероксидазою хрону, а не неселективним барвникам DCFDA; перевіряйте сигнал за допомогою каталази й тестуйте залежність від освітлення, оскільки барвник є фотосенсибілізатором. Дослідження мітохондрій мозку показало, що пероксидне навантаження зростало більш ніж у чотири рази вже за 100 nM барвника, тоді як усунення пероксиду сповільнювалося; пероксид утворювався безпосередньо за участю відновленого барвника, без проміжного утворення супероксиду. Подробиці вибору зондів і контролю освітлення наведено в супровідній статті про вимірювання активних форм кисню в дослідах із барвниками, а ширше питання про те, коли пероксид діє як сигнал, а коли — як навантаження, розглянуто разом із темою клітинного редокс-балансу та тверджень про антиоксидантну дію.

Для тверджень про шляхи перевіряйте обидві ділянки інгібування комплексу III: антиміцин A на ділянці Qi та міксотіазол на ділянці Qo, а також кінцеве блокування комплексу IV ціанідом. Раніше дослідження мозку мишей повідомляло про відновлення барвником дихання, заблокованого ротеноном, але не антиміцином, тоді як пізніше дослідження на трьох видах виявило часткове відновлення за обох інгібіторів і ознаки прямого відновлення цитохрому c. Розглядайте обхідний шлях як такий, що узгоджується з новішими даними, а не як остаточно встановлений, оскільки концентрація барвника, ділянка дії інгібітора, стан субстратів і розподіл барвника змінюють спостережуваний маршрут.

Матриця вибору аналізів

Використовуйте цю таблицю, щоб обирати вимірювання відповідно до запитання, а не навпаки.

Мінімально переконливе твердження потребує перевірки тих самих концентрацій барвника — 100 nM, 300 nM, 1 uM і 2 uM — у вимірюваннях потоку кисню за умов витоку протонів, додавання ADP, олігоміцину та роз’єднувача; швидкості синтезу ATP; мембранного потенціалу, бажано за допомогою двох зондів; і каліброваного виділення пероксиду з каталазою та безклітинними контролями. Наводьте взаємопов’язаний набір: потік кисню разом зі швидкістю синтезу ATP, відношенням ATP до кисню, потенціалом і пероксидом. Будь-яке з цих чисел окремо — це вимірювання, яке ще потребує осмислення.