Метиленовий синій і світлове опромінення: довжина хвилі, опроміненість і геометрія процедури

Дві наукові публікації повідомляють про опромінення метиленового синього світлом із дозою 10 J на квадратний cm. В одному дослідженні бактерії гинуть. В іншому немає жодного вимірюваного результату. Читач, який порівнює лише дозу, робить висновок, що результати в цій галузі суперечливі. Насправді вони узгоджуються. Доза ніколи не описувала всю експозицію.

Світлова експозиція — це невелика система параметрів, які діють разом: довжина хвилі, опроміненість, тривалість, отриманий флюенс, доступність кисню, концентрація барвника та його агрегатний стан, інтервал між застосуванням барвника й опроміненням, а також оптичний шлях, який світло насправді проходить крізь зразок. Зміна одного параметра змінює фотохімію. У цій статті розглянуто кожен параметр, а потім розмежовано фотобіомодуляцію ближнім інфрачервоним світлом і пряму фотоактивацію барвника, оскільки саме ці два режими найчастіше плутають.

Довжина хвилі визначає, чи бере барвник участь у процесі

Метиленовий синій у воді у формі мономера сильно поглинає червоне світло: максимум розташований поблизу 664–665 nm, а плече спектра на коротшій довжині хвилі, поблизу 610 nm, зростає в міру агрегування барвника в димери та більші стеки. Молярний коефіцієнт екстинкції поблизу максимуму становить приблизно 65,000–85,000 M-1 cm-1, тому навіть мікромолярні розчини вже мають інтенсивний синій колір. Ранній огляд фотохімії метиленового синього з ДНК і біологічними субстратами описує таке поглинання та подальшу хімію збуджених станів: поглинання переводить молекули в короткоживучий синглетний стан, після чого відбувається перехід у довгоживучіший триплетний стан із повідомленим виходом близько 0.5, який в аерованому розчині гаситься киснем приблизно за 2 мікросекунди.

Саме на етапі гасіння розходяться два фотохімічні шляхи. У фотохімії типу II барвник у триплетному стані передає енергію кисню в основному стані та утворює синглетний кисень; часто наводять вихід близько 0.52. У фотохімії типу I триплет натомість передає субстрату електрон або водень, утворюючи радикали, зокрема супероксидні та гідроксильні. Обидва шляхи можуть діяти одночасно, а традиційний фотодинамічний ефект залишається сильно залежним від кисню навіть за участі механізму типу I.

Звідси випливає просте правило вибору довжини хвилі для метиленового синього. Червоне світло приблизно від 630 до 680 nm перекриває смугу поглинання барвника, а діапазон 660–665 nm розташований поблизу максимуму мономера, тому таке світло може запускати фотосенсибілізовані хімічні реакції всюди, де є значуща кількість барвника. Ближнє інфрачервоне світло при 810 nm лежить далеко за межами смуги поглинання основного стану, тому ця довжина хвилі погано підходить для прямого збудження барвника. Концентрація ускладнює картину в один конкретний спосіб: зі зростанням концентрації більша частка барвника перебуває в димерних та агрегованих формах, які поглинають ближче до 610 nm і менш ефективно фотосенсибілізують у розрахунку на молекулу. Отже, подвоєння кількості барвника не подвоює ефект. У супровідному огляді метиленового синього й терапії червоним світлом це правило поглинання розглядається як передумова будь-якої фотосенсибілізованої реакції.

Опроміненість, тривалість і флюенс — це три параметри, а не один

Флюенс, виражений у J на квадратний cm, дорівнює опроміненості, помноженій на час. Якщо повідомляти лише флюенс, це приховує швидкість надходження енергії, а ця швидкість має значення.

Короткочасне опромінення з високою опроміненістю та тривале опромінення з низькою опроміненістю можуть давати однаковий флюенс, але різну фотохімію. За високої опроміненості розчинений кисень витрачається швидше, ніж поповнюється шляхом дифузії, що пригнічує киснезалежний шлях типу II ще до завершення експозиції. Також виділяється тепло, а тканина реагує на нагрівання змінами кровотоку, які впливають і на оксигенацію, і на розподіл барвника. Низька опроміненість за тривалої експозиції підтримує постачання кисню, але дає процесам відновлення та повторної оксигенації час діяти вже під час самого опромінення. У підручниках із фотохімії припущення, що значення має лише загальна доза, називають принципом взаємності. Він не працює, коли в процесі беруть участь кисень, нагрівання або біологічні механізми, а в тканинах це означає майже завжди.

В антимікробних фотодинамічних процедурах із метиленовим синім у людей зазвичай використовують 6–18 J на квадратний cm, що перекривається зі значеннями для фотобіомодуляції. Тому лише за флюенсом визначити режим неможливо. Експозиція 10 J на квадратний cm при 660 nm у тканині, що містить барвник, — це фотохімія, зумовлена фотосенсибілізатором. Такий самий флюенс при 810 nm у тканині зі слідовою кількістю барвника — зовсім інший процес. Число збігається. Принцип відрізняється.

Оптичний шлях і геометрія зразка визначають, із чим взаємодіє світло

Закон Бугера — Ламберта — Бера означає, що передня частина зразка отримує значно більше світла, ніж задня. У кюветі з концентрацією барвника в десятки мікромолів на літр перший міліметр може поглинути більшість падаючого червоного світла, залишаючи глибші шари фактично неопроміненими. Якщо помістити той самий розчин у неглибоку лунку в малому об’ємі, експозиція стане майже рівномірною. Той самий барвник, та сама лампа, той самий флюенс на поверхні — інший результат.

У тканинах до поглинання додається розсіювання. Червоне світло поблизу 660 nm проникає на глибину порядку міліметрів; точна глибина залежить від вмісту крові, пігментації та типу тканини. Лунки додають власні артефакти: лінзування меніском, відбиття від стінок, затінення крайніх лунок і нагрівання малих об’ємів під джерелом. Дві лабораторії, які повідомляють про однакові налаштування лампи, але використовують різні типи планшетів, об’єми або відстані до джерела, провели різні експерименти.

Відстань заслуговує на особливу увагу, оскільки це найпоширеніша невказана змінна. Опроміненість швидко зменшується зі збільшенням відстані від неколімованого джерела, тому переміщення лампи з 2 cm до 5 cm над планшетом може знизити опроміненість у кілька разів, хоча опис у розділі методів залишиться тим самим. Без вимірювання опроміненості на поверхні зразка опубліковані значення флюенсу, обчислені за заявленою виробником потужністю, є оцінками, а не вимірюваннями.

Параметри з поясненнями: що робить експозицію відтворюваною

Оригінальний матеріал для цієї сторінки — контрольний список. Світлову експозицію в дослідженні, де пропущено ці пункти, неможливо порівняти з іншою, хоч би якою подібною здавалася заявлена доза.

1. Довжина хвилі та ширина спектральної смуги. Максимум і повна ширина, а не назва кольору. Червоні LED охоплюють діапазон 630–680 nm, у якому поглинання барвника дуже відрізняється.
2. Виміряна опроміненість на поверхні зразка, у mW на квадратний cm. Потужність, заявлена виробником, — не опроміненість.
3. Тривалість та імпульсний режим. Безперервне чи імпульсне опромінення, зокрема частота імпульсів і коефіцієнт заповнення, де це застосовно.
4. Флюенс, обчислений за наведеними вище виміряними опроміненістю та тривалістю, у J на квадратний cm.
5. Концентрація барвника, склад препарату та стан агрегації. Мономер поблизу 664 nm фотосенсибілізує інакше, ніж агрегати поблизу 610 nm.
6. Інтервал між введенням препарату та опроміненням. Хвилини або години між введенням барвника й опроміненням, які визначають, де перебуває барвник у момент надходження світла.
7. Оксигенація. Аерований розчин порівняно з гіпоксичною тканиною безпосередньо змінює співвідношення механізмів типу I та типу II.
8. Геометрія. Глибина зразка, об’єм, тип посудини, відстань до джерела та його кут, а також глибина цільової ділянки тканини.

Корисна звичка під час читання наукових публікацій: спочатку перевіряйте інтервал між введенням препарату та опроміненням. Він розкриває задум дослідження. У фотодинамічних дослідженнях навмисно опромінюють тканину, що містить барвник. У комбінованих дослідженнях ці два втручання можуть навмисно розділяти в часі, як у прикладах нижче.

Фотобіомодуляція ближнім інфрачервоним світлом — не фотоактивація барвника

Фотобіомодуляція, яку зазвичай скорочують як PBM, використовує червоне або ближнє інфрачервоне світло для модулювання ендогенних сигнальних процесів без додавання фотосенсибілізатора. Фотодинамічна терапія, яку зазвичай скорочують як PDT, поєднує три складники: світло, яке поглинає сенсибілізатор, сам сенсибілізатор і кисень, щоб утворити сплеск реакційноздатних частинок, які пошкоджують ціль. В огляді мітохондрій як мішені нейропротекції метиленовий синій розглядають разом із PBM, оскільки вони впливають на клітинне дихання різними шляхами: барвник діє як каталізатор циклічних окисно-відновних перетворень, підтримуючи потік електронів, тоді як PBM, за гіпотезою, сприяє дисоціації інгібувального оксиду азоту від цитохром-c-оксидази в комплексі IV. Цей ферментний механізм слід і надалі позначати як гіпотезу.

В обох найчастіше цитованих дослідженнях комбінованого впливу на мишах використовують світло 810 nm, і саме тому вони не демонструють фотоактивації барвника. У дослідженні попереднього впливу перед позбавленням сну миші до позбавлення сну отримували щодня метиленовий синій у кількості 0.5 mg на kg, імпульсне лазерне опромінення 810 nm через день або обидва втручання. Комбінований попередній вплив захищав поведінкові показники пам’яті та синаптичні білки гіпокампа, тоді як окремі втручання здебільшого не давали такого результату. У дослідженні хронічного стресу з лікуванням у той самий період миші отримували PBM при 810 nm із флюенсом 8 J на квадратний cm разом зі щоденним введенням барвника в кількості 0.5 mg на kg. Спочатку застосовували лазер, а барвник вводили ін’єкційно через дві години — спеціально, щоб не опромінювати тканину, яка містить барвник. У всіх трьох групах усувалися порушення навчання, а додаткова користь поєднання стосувалася переважно рівня кортизолу в сироватці та активних форм кисню в мозку. Ці результати перевіряють два мітохондріальні втручання, застосовані разом. Добірка фотодинамічних досліджень зберігає цю відмінність видимою, зазначаючи довжину хвилі для кожного показання.

Дані щодо шкіри належать до іншого режиму. Дані про застосування метиленового синього зі світлом на шкірі людей зосереджені в діапазоні 630–680 nm, із місцевим нанесенням або введенням барвника безпосередньо в ураження та з метою руйнування чи ремоделювання, що за визначенням є PDT. Посилатися на таке усунення уражень як на доказ того, що барвник посилює PBM, або на відновлення показників у мишей при 810 nm як на доказ того, що панель 660 nm разом із барвником є протоколом для когнітивних функцій, — означає змішувати режими. Довідник із дозування та фармакології й посібник із безпеки та взаємодій докладніше розглядають частини цієї теми, що стосуються концентрації та протипоказань.

Перш ніж порівнювати числа, визначте, про який процес ідеться. Довжина хвилі визначає, чи поглинає барвник світло. Опроміненість і тривалість визначають, які хімічні процеси відбуваються внаслідок цього поглинання. Геометрія визначає, яка частина зразка взагалі зазнає такого впливу. Дві експозиції, що збігаються за одним параметром і відрізняються за рештою, — це різні експерименти. Розглядати їх як взаємозамінні — саме та помилка, якій має запобігти цей посібник. Із цього не випливає жодного протоколу для домашнього застосування; поєднання світла з довжиною хвилі, що відповідає поглинанню барвника, та системного застосування барвника перетворює вплив, який інакше був би модулювальним, на фотохімію, зумовлену фотосенсибілізатором, а це належить до компетенції клінічних фахівців.