Метиленовий синій, Nrf2 і мітохондріальний біогенез: пояснення

У текстах про метиленовий синій часто трапляється одне речення: він активує Nrf2 і створює нові мітохондрії. Це речення читається як одне твердження, але містить два різні поняття, досліджені в різних системах і підтверджені різними видами доказів. Перше — сигнальний шлях, сенсор, що вмикає захисні гени. Друге — програма побудови, за якою клітина створює більше мітохондріального апарату. Сигнал може запустити побудову, але показати, що сигнал спрацював, — не те саме, що показати, що будівля постала. А показати більше будівельного матеріалу — не те саме, що показати краще енергопостачання. У цій статті ці три речі розглядаються окремо.

Поняття Nrf2: сенсор, а не щит

Nrf2 (фактор 2, споріднений з ядерним еритроїдним фактором 2) — це транскрипційний фактор, білок, завдання якого — вмикати гени. У стані спокою його утримує в цитоплазмі сенсорний білок Keap1, який передає його клітинному апарату утилізації для безперервного руйнування. Коли окисники або електрофіли модифікують реакційноздатні залишки цистеїну в Keap1, утилізація припиняється. Новоутворений Nrf2 накопичується, переміщується до ядра, утворює пари з малими білками Maf і зв’язується з послідовностями ДНК, які називають елементами антиоксидантної відповіді. Це зв’язування вмикає цілу групу захисних генів.

Канонічні показники цього шляху є специфічними. NQO1 (NAD(P)H-хінон-дегідрогеназа 1) і TrxR1 (тіоредоксинредуктаза 1) належать до найнадійніших генів-мішеней Nrf2. HO-1 (гемоксигеназа-1) здатна до вираженої індукції, але реагує й на інші регулятори. Такі ферменти, як SOD і каталаза, є частиною антиоксидантного апарату, проте їхні рівні контролюються багатьма транскрипційними факторами, тому саме по собі підвищення SOD не доводить, що причиною був Nrf2. Найближчі до самої сигнальної події докази — це накопичення Nrf2 у ядрі, активація репортера ARE або індукція канонічних мішеней, яка зникає після усунення Nrf2. Усе інше — нижчі рівні окисників, краща виживаність за стресу, вищий рівень глутатіону — є подальшими ефектами, які можуть спричиняти багато шляхів.

Найраніший результат щодо метиленового синього в цій історії перебуває ближче до сигнальної події на цій шкалі. У фібробластах, на які впливали наномолярними концентраціями метиленового синього, спостерігали відтермінування клітинного старіння разом із вищим вмістом комплексу IV, більшим споживанням кисню та індукцією ферментів фази 2 — TrxR1 і NQO1. Це описано в дослідженні, яке вперше пов’язало метиленовий синій із посиленням мітохондріальної функції та відтермінуванням клітинного старіння. TrxR1 і NQO1 — саме ті канонічні мішені Nrf2, які уважний читач хоче побачити. Чого дослідження не показало, то це самої сигнальної події: не було вимірювання ядерного Nrf2, репортера ARE чи контрольного експерименту з нокаутом Nrf2. Тож коректний висновок такий: метиленовий синій індукує відомі гени-мішені Nrf2 у цій системі, що узгоджується з активацією Nrf2, але не виокремлює Nrf2 як причину. Індукція гена-мішені розташована на один крок далі від самого перемикача.

Поняття біогенезу: програма з трьома контрольними точками

Мітохондріальний біогенез — це програма, за якою клітина нарощує мітохондріальну потужність. Її класична ієрархія проходить через три контрольні точки. По-перше, коактиватор PGC-1alpha вмикає програму. По-друге, ядерні транскрипційні фактори (що може збивати з пантелику, один із них називається NRF1 — ядерний респіраторний фактор 1, і це інший білок, ніж Nrf2) стимулюють експресію мітохондріальних генів, зокрема TFAM, який підтримує та реплікує мітохондріальну ДНК. По-третє, у клітині зрештою стає більше мітохондріальних геномів і дихального апарату, що можна виміряти за кількістю копій mtDNA, активністю цитратсинтази або кількістю й активністю дихальних комплексів.

Кожна контрольна точка дає підстави для твердження іншої сили, ніж попередня. Вищий рівень матричної РНК PGC-1alpha або TFAM показує, що на запуск програми надійшов запит, а не що вона завершилася. Більше mtDNA або білка комплексу IV означає більше матеріалу, але перебудовані мітохондрії можуть виглядати так само. Краще дихання, більше споживання кисню або вища активність комплексів показують, що функція змінилася, але функція може покращитися взагалі без утворення нових мітохондрій. Переконливе твердження про біогенез поєднує всі три складові: регулятор, вміст і функцію.

Подальше дослідження фібробластів простежило більшу частину цього ланцюга. У людських клітинах IMR90, оброблених метиленовим синім у концентрації 100 наномолярів, співвідношення NAD до NADH тимчасово зростало протягом 15 хвилин і поверталося до вихідного рівня протягом доби. Після цього короткочасного енергетичного сигналу відбувалося короткочасне фосфорилювання енергетичного сенсора AMPK, а потім — індукція PGC-1alpha та SURF1, білка, потрібного для складання функціонального комплексу IV. Активність комплексу IV приблизно подвоїлася, рівень клітинних окисників знизився приблизно на 28 відсотків, а теломери скорочувалися повільніше. Повну послідовність викладено в статті, що пов’язує окисно-відновну активність метиленового синього з AMPK і мітохондріальним біогенезом.

Дві деталі цієї статті заслуговують на увагу, адже саме такі деталі зазвичай випускають. По-перше, характер активації мав більше значення, ніж її наявність: метиленовий синій вмикав AMPK короткочасно, тоді як препарат порівняння AICAR — тривало, і короткочасний активатор відтерміновував клітинне старіння приблизно у вісім разів ефективніше. Тому твердження на кшталт «метиленовий синій активує AMPK» є неповним; суттєво те, що він активує AMPK короткочасно, а порівняння свідчить, що тривала активація не дає того самого результату. По-друге, метиленовий синій не змінював клітинного циклу, що виключає найбанальніше альтернативне пояснення: клітини просто ділилися повільніше й через це виглядали молодшими.

Дослідження на мишах: поведінка, геноми та навмисно парадоксальний пусковий механізм

Роботу на клітинних культурах продовжила на тваринах група, яка досліджувала мишей середнього віку. Після 60 днів перорального введення метиленового синього миші, які його отримували, краще зберігали фізичну витривалість і дослідницьку поведінку та демонстрували менше тривогоподібної поведінки, ніж старі миші, які його не отримували. У тканині мозку експресія генів, пригнічена старінням, — NRF1, TFAM, SOD2 і COX1, субодиниці комплексу IV, — відновлювалася в напрямку рівнів дорослих тварин, а кількість копій mtDNA зростала. Ці результати — поведінка, регулятор і кількість геномів — наведено в дослідженні метиленового синього та мітохондріального біогенезу в мозку мишей середнього віку.

Найцікавішим є запропонований пусковий механізм, оскільки він суперечить простому уявленню про метиленовий синій як антиоксидант. У мишей, які його отримували, спостерігали посилене утворення активних форм кисню в мітохондріях мозку, зокрема перекису водню. Автори припустили: саме слабкий перекисний сигнал активує шлях Nrf2, який потім запускає програму біогенезу. У цій моделі метиленовий синій є прооксидантом на етапі запуску й антиоксидантом на етапі результату. Фармакологи називають таку закономірність гормезисом: невеликий стрес викликає захисну відповідь, сильнішу за сам стрес. Чи справді це підвищення рівня перекису спричиняє активацію Nrf2, безпосередньо не перевіряли; це запропонований зв’язок, а не виміряна ланка.

Супутнє дослідження тієї самої групи перевірило аспект безпеки цього припущення. В ізольованих мітохондріях мозку метиленовий синій підвищував утворення перекису водню вже за концентрації 50 наномолярів, проте терапевтичні концентрації не спричиняли виявлюваного пошкодження мітохондріальної ДНК. Лише за концентрації 100 мікромолярів, значно вищої за терапевтичні рівні, окремі фрагменти mtDNA демонстрували пошкодження. А поєднання барвника в концентрації 20 мікромолярів із червоним світлом утворювало синглетний кисень, який широко пошкоджував mtDNA. Це відома фотосенсибілізувальна дія барвника, а не його фармакологічна дія без освітлення. Попередня обробка навіть захищала мітохондрії вентральної частини середнього мозку від спричинених ротеноном пошкоджень mtDNA. Залежність ефекту від дози та контрольні перевірки генотоксичності докладно описано в дослідженні утворення перекису під дією метиленового синього без генотоксичності.

Виміряне та припущене: як читати схему

Наведену нижче схему шляху створено для цієї статті, щоб чітко показати розмежування, яке проводиться в тексті. Блоки із суцільними рамками позначають етапи, що мають пряме експериментальне підтвердження в літературі про метиленовий синій: окисно-відновне циклування, яке змінює NAD/NADH, короткочасне фосфорилювання AMPK, індукцію PGC-1alpha та SURF1, вищу активність комплексу IV, індукцію NQO1 і TrxR1, відновлення експресії генів біогенезу та кількості копій mtDNA в мозку мишей, а також підвищення рівня перекису без пошкодження mtDNA за терапевтичних доз. Блоки з пунктирними рамками позначають припущені ланки: сприйняття перекисного сигналу білком Keap1, накопичення Nrf2 у ядрі, яке запускає захисні гени, та причинний зв’язок між активацією Nrf2 і програмою біогенезу. Ці пунктирні етапи правдоподібні, узгоджуються з даними й відповідають загальноприйнятим біологічним уявленням. Однак у цих статтях їх не вимірювали з контрольними перевірками — ядерним Nrf2, репортерами ARE, нокаутом Nrf2, — які дали б підстави замінити пунктирні рамки суцільними.

Коли схема перед очима, стають помітними три джерела плутанини. По-перше, NRF1 і Nrf2 — різні білки з майже однаковими назвами; у дослідженні на мишах вимірювали ядерний респіраторний фактор 1, регулятор біогенезу, а не антиоксидантний транскрипційний фактор. Їх ототожнення зводить усю схему до одного вузла. По-друге, експресія генів — це початок історії, а не її кінець; відновлення рівнів матричної РНК TFAM або COX1 підтверджує запит на біогенез, тоді як кількість копій mtDNA та активність комплексу IV є доказами того, що запит виконано. По-третє, антиоксидантний результат не доводить участі шляху Nrf2; зниження рівня окисників на 28 відсотків у фібробластах і захист від ротенону в мишей — реальні подальші ефекти, але до них ведуть кілька шляхів.

Що дало б підстави замінити пунктирну рамку суцільною

Відсутні експерименти є стандартними. Вимірювання ядерного білка Nrf2 після впливу метиленового синього з часовим відстеженням, узгодженим із короткочасним сигналом AMPK, дало б змогу перевірити, чи справді обидві гілки спрацьовують разом, як стверджує гіпотеза синхронізованої активації. Репортер під контролем ARE підтвердив би транскрипційну активність, а не дозволяв би лише робити висновок про неї за генами-мішенями. Повторне вимірювання показників біогенезу після нокдауну або нокауту Nrf2 безпосередньо перевірило б причинний зв’язок: якщо індукція комплексу IV та збільшення кількості mtDNA зберігаються без Nrf2, припущення про зв’язок хибне, а ефект забезпечує лише гілка AMPK. У тварин дослідження тривалого введення з тими самими трьома контрольними точками — регулятор, вміст, функція — дало б змогу перевірити, чи залишається програма активною, чи адаптується. До того часу синхронізована активація енергетичних і захисних шляхів залишається тим, чим її назвали автори: можливим ключовим чинником, а не встановленим механізмом.

Читачам, які розглядають тему в ширшому фармакологічному контексті, може знадобитися додаткова інформація: як метиленовий синій переносить електрони на мітохондріальному рівні, як ще він впливає на мітохондрії та клітинну енергетику, яке місце результати щодо клітинного старіння посідають у дослідженнях старіння, як твердження про біогенез співвідносяться з когнітивними показниками та які дані про безпеку задають межі будь-якого обговорення дозування. Кожне з цих питань є окремим поняттям із власними доказами, і кожне заслуговує на таке саме розмежування виміряного та припущеного, яке в цій статті застосовано до Nrf2.