Метиленовий синій і нейромедіатори: серотонін, дофамін, ГАМК та ацетилхолін

Про метиленовий синій часто кажуть, що він одночасно підвищує серотонін, підвищує дофамін, заспокоює через ГАМК і посилює дію ацетилхоліну. Це речення подає чотири окремі лабораторні результати як один ефект в організмі людини. Дослідження, на яких воно ґрунтується, вимірювали різні мішені в різних експериментальних препаратах за концентрацій, що відрізняються приблизно в тисячу разів. Якщо розглянути мішені окремо, картина стає водночас цікавішою та обережнішою, ніж дозволяє це єдине речення.

Основна ідея проста. Молекула, яка зв’язується з ферментом у пробірці, зробила лише одне: зв’язалася з ферментом у пробірці. Чи змінить це рівень нейромедіатора в живому мозку, залежить від концентрації, яка досягає тканини, від хімічної форми молекули на момент її надходження та від усіх інших дій цієї молекули за тієї самої концентрації. У кожному розділі нижче ці три питання розглядаються разом із відповідним результатом.

Серотонін: дві мішені, дві концентрації

Із чотирьох систем найпереконливіші докази стосуються серотоніну. Вони походять від двох різних молекулярних мішеней, які не слід об’єднувати.

Перша мішень — моноаміноксидаза типу A, мітохондріальний фермент, що розщеплює серотонін. Метиленовий синій пригнічує очищену людську MAO-A як інгібітор із міцним зв’язуванням і Ki близько 27 наномолярів, тоді як для впливу на MAO-B потрібні значно вищі концентрації. Це показано в кінетичному дослідженні, яке пов’язало барвник із серотоніновою токсичністю. Суміжний напрям досліджень виявив таку саму вибірковість у тканині епіфіза щурів: блокада MAO-A підвищувала рівні індолів, похідних серотоніну, знижувала рівень його метаболіту 5-HIAA та змінювала пов’язаний із серотоніном рефлекс випрямлення у жаб. Про це повідомлено в дослідженні окисно-відновних барвників та індолів епіфіза. Два різні експериментальні препарати, однаковий напрям: менше розщеплення, більше збереженого серотоніну там, де фермент мав би його усунути.

Друга мішень — сам транспортер серотоніну. У клітинах, що експресують людський транспортер, метиленовий синій зменшував поглинання як флуоресцентного субстрату, так і міченого серотоніну з IC50 близько 1.4 мікромоляра, а також пригнічував спричинені серотоніном струми під час реєстрації методом петч-клемп. Це описано в дослідженні безпосередньої дії метиленового синього на SERT. Автори перевірили очевидні альтернативні пояснення й установили, що ефект не залежав від сигналізації через cGMP, змін рівня кальцію та експресії транспортера на поверхні клітини.

Зверніть увагу на різницю між цими двома числами. Пригнічення MAO-A відбувається в наномолярному діапазоні. Для пригнічення транспортера потрібно приблизно в п’ятдесят разів більше барвника. Низька експозиція, яка повністю залучає фермент, може майже не впливати на транспортер. Об’єднуючи ці результати в одне твердження про серотонін, два різні діапазони доз фактично зводять до одного.

Чи має будь-яка з цих мішеней значення для людини, яка приймає інші серотонінергічні препарати, — питання застосування ліків, якому присвячено посібник із лікарських взаємодій. Ця стаття описує мішені; клінічні рекомендації містяться на тій сторінці.

Дофамін: найслабші прямі докази

Щодо дофаміну чесність вимагає найбільшої стриманості. Немає загальновизнаного дослідження, яке показувало б, що метиленовий синій блокує транспортер дофаміну або безпосередньо зв’язується з дофаміновими рецепторами. Часто цитоване значення IC50 транспортера — 1.4 мікромоляра — стосується транспортера серотоніну, а не DAT, і його ніколи не слід приписувати іншій мішені.

Натомість наявні дані є непрямими. Оскільки ферменти MAO також метаболізують дофамін, пригнічення MAO зберігає дофамін разом із серотоніном і норадреналіном. У мітохондріальних препаратах метиленовий синій блокував опосередковане MAO-B перетворення нейротоксину MPTP на його токсичний для дофамінергічних нейронів продукт із потужністю, порівнянною з депренілом — препаратом проти хвороби Паркінсона. Це описують дослідження біоактивації MPTP та пов’язані роботи щодо MAO-B. Дослідження на тваринах додають окремі фрагменти: приблизно трикратне підвищення базального вивільнення дофаміну зі зрізів стріатума щурів за 10 мікромолярів, досліджене в контексті сигналізації оксиду азоту, а не блокади транспортера, а також неоднорідні результати в різних ділянках після системного введення. У деяких дослідженнях рівні серотоніну й норадреналіну зростали, тоді як рівень дофаміну майже не змінювався.

Отже, дані щодо дофаміну реальні, але опосередковані. Вони стосуються ферменту, який обробляє кілька моноамінів одночасно, а не специфічної для дофаміну мішені. Будь-яке твердження про те, що метиленовий синій підвищує дофамін у людей, оминає етап, на якому це мало б бути фактично продемонстровано.

ГАМК: блокування гальмування в кишені зв’язування

Результат щодо ГАМК є точним і суперечить звичній репутації барвника. У клітинах, що експресують людські рецептори GABA-A, метиленовий синій пригнічував спричинені ГАМК струми, починаючи приблизно з 3 мікромолярів, з IC50 близько 31 мікромоляра для поширеної конфігурації alpha1-beta2-gamma2. Це показано в електрофізіологічному дослідженні, яке визначило ділянку дії.

Визначення ділянки дії — найцінніша частина цього результату. Мутації в ділянці зв’язування пікротоксину не змінювали пригнічення, а ділянки зв’язування бензодіазепінів і цинку були виключені шляхом порівняння субодиниць. Натомість мутації двох амінокислотних залишків, які, як відомо, утворюють саму кишеню зв’язування ГАМК, різко послаблювали блокаду. Це вказує на конкурентний антагонізм у ділянці зв’язування агоніста, а не на алостеричну модуляцію в іншому місці. Ефект зберігався для синаптичних і позасинаптичних комбінацій субодиниць та швидко зникав після відмивання.

Це створює справжню суперечність, яку варто назвати прямо. Молекула, яку досліджують для підтримки пам’яті, водночас пригнічує швидку гальмівну передачу в лабораторній культурі. Чи відбувається таке пригнічення в живому мозку, залежить від локальної концентрації, а 31 мікромоляр — високе значення порівняно з більшістю рівнів системної експозиції, що розглядається в завершальному розділі. Сама суперечність і є результатом; для її розв’язання потрібні експерименти, яких ще ніхто не проводив.

Ацетилхолін: дві протилежні точки впливу

Щодо ацетилхоліну є два результати, спрямовані в протилежні боки, і саме тому їх потрібно подавати окремо.

З одного боку, метиленовий синій пригнічує ферменти, які усувають ацетилхолін. Ацетилхолінестераза еритроцитів корів конкурентно пригнічувалася приблизно за 0.57 мікромоляра, фермент великої рогатої худоби — близько 0.42 мікромоляра, а естеразна активність плазми людини — близько 1.1 мікромоляра. Бутирилхолінестераза пригнічувалася в діапазоні приблизно від 0.4 до 5.3 мікромоляра залежно від виду та експериментального препарату. Ці дані узагальнено в огляді дії метиленового синього в нервовій системі. Уповільнення усунення залишає більше нейромедіатора в синапсі — така сама логіка лежить в основі дії кількох схвалених препаратів проти хвороби Альцгеймера.

Але тут є хімічна умова. Окиснена синя форма пригнічує фермент, а відновлена безбарвна — ні. Тривалі інкубації, під час яких барвник встигає відновитися, дають слабше пригнічення вже лише з цієї причини. Будь-яке числове значення з аналізу холінестерази має приховану змінну: яка частка барвника залишалася синьою на момент вимірювання.

З іншого боку, метиленовий синій блокує нікотиновий рецептор alpha7 — один із рецепторів, на які діє ацетилхолін. Людські рецептори alpha7, експресовані в ооцитах жаб, пригнічувалися з IC50 близько 3.4 мікромоляра через неконкурентний, незалежний від напруги антагонізм, який не змінював потужності агоніста. А 3 мікромоляри усували спричинені холіном синаптичні відповіді у зрізах гіпокампа щурів, як повідомляє дослідження рецептора alpha7. Отже, за близьких концентрацій у низькому мікромолярному діапазоні барвник одночасно зберігає нейромедіатор і послаблює один із його рецепторів. Сукупний ефект на холінергічну сигналізацію не можна визначити з будь-якого з цих результатів окремо. Ця неоднозначність пов’язана з ширшою літературою про хворобу Альцгеймера та з суміжним обговоренням досліджень когнітивних функцій і захворювань, але тут вона залишається нерозв’язаною.

Порівняння в одному місці

Найчутливішу мішень від найменш чутливої відділяють три порядки величини. Цей розкид — суть статті в одній таблиці.

Чи досягає мозок таких концентрацій?

Число з пробірки нічого не означає без числа, що описує експозицію. Після внутрішньовенного болюсного введення близько 1.4 mg на kg повідомляли про середні рівні в плазмі людини близько 5 мікромолярів, тоді як у тій самій дослідницькій літературі пероральна доза 100 mg давала рівні в цільній крові близько 0.08 мікромоляра. Дослідження розподілу у щурів виявляють рівні в мозку приблизно в десять–двадцять разів вищі за рівні в кровообігу. Проте це загальна кількість барвника в гомогенізованій тканині, а не вільний окиснений барвник у синапсі. До того ж зв’язування з білками плазми на рівні близько 94 відсотків і розподіл у клітини крові зменшують вільну фракцію.

Якщо зіставити ці дані з таблицею, картина виявляється градуальною, а не бінарною. Концентрації, потрібні для пригнічення MAO-A, значно нижчі за типові рівні експозиції після внутрішньовенного введення, тому цей ефект фармакологічно правдоподібний за такого способу введення барвника. Ефекти на холінестеразу та alpha7 лежать у низькому мікромолярному діапазоні, з яким перетинаються пікові рівні після внутрішньовенного введення, але якого звичайні пероральні дози можуть не досягати. IC50 для GABA-A у 31 мікромоляр перевищує більшість правдоподібних рівнів системної експозиції, тому саме цю блокаду найважче припускати в цілісному організмі людини. Кожен рядок цього порівняння потребує однакового застереження: значення має концентрація вільного окисненого позаклітинного барвника біля мішені — величина, яку жоден аналіз крові не вимірює безпосередньо.

Яких висновків не слід робити

Жоден рядок таблиці не доводить, що метиленовий синій передбачувано підвищує або знижує рівень будь-якого нейромедіатора в людини. Пригнічення ферменту в очищеному препараті, блокада транспортера в клітинній лінії та антагонізм рецептора у зрізі тканини — кожен із цих результатів отримано в контрольованих умовах, на крок віддалених від реальності синапсу. А розділ про холінергічну систему показує, як два достовірні результати разом залишають невизначеність. Відповідально використовувати цю сторінку як карту мішеней, взаємодію молекули з якими було продемонстровано, із зазначенням сили цієї взаємодії, щоб обговорення механізмів спиралося на те, що фактично виміряли. Про те, як ці точки впливу взаємодіють із призначеними ліками, ідеться в посібнику із взаємодій. Додатковий контекст містять матеріали про основи фармакології та супровідне пояснення механізмів.