Стаття
Чому метиленовий синій використовують як контрастний барвник під час фарбування на кислотостійкість
Лаборант досліджує мазок мокротиння після повної послідовності фарбування. Червоні палички вирізняються на синьому полі, і у висновку зазначають: виявлено кислотостійкі бацили. Наступного дня на іншому склі видно однорідне синє поле без червоних паличок, і результат описують як негативний на туберкульоз. Один із цих висновків стверджує більше, ніж дозволяє препарат, і це не перший.
Плутанина виникає на рівні розуміння принципу. Лаборант сприйняв синій барвник як частину хімічного механізму виявлення, наче метиленовий синій допомагав знаходити мікобактерії. Це не так. До моменту, коли метиленовий синій потрапляє на предметне скло, сам тест уже завершено. Барвник лише забарвлює фон, щоб результат можна було прочитати. У цій статті пояснюється призначення метиленового синього у фарбуванні на кислотостійкість, чому використовують саме синій, а не інший колір, і які висновки дозволяє зробити червоне на синьому.
Коротка відповідь
Фарбування на кислотостійкість — це диференційний тест, побудований на трьох принципах. Карболовий фуксин, основний барвник, примусово вводять у кожну клітину, зокрема в мікобактерії з восковою оболонкою. Кислотний спирт, знебарвлювач, видаляє червоний барвник зі звичайних клітин, але не може вилучити його з кислотостійких. Потім метиленовий синій, контрастний барвник, забарвлює все, з чого знебарвлювач видалив основний барвник. Тому некислотостійкі клітини, клітини організму-хазяїна та клітинні уламки виглядають синіми, тоді як кислотостійкі бацили залишаються червоними. Контрастний барвник забезпечує контраст. Він не бере участі в хімічному механізмі, що зумовлює кислотостійкість клітини.
Що відбувається на кожному етапі
Наведена нижче схема показує розподіл функцій. Читайте її зліва направо як послідовність процедури, а нижню смугу — як нагадування про те, що кожна група методів фарбування відповідає на своє запитання.
Спочатку відбувається проникнення. Мікобактерії протистоять звичайним водним барвникам, оскільки їхня оболонка надзвичайно гідрофобна, тому протокол забезпечує примусове проникнення. У методі Ціля — Нільсена нагрівання до появи пари сприяє проникненню карболового фуксину, що містить фенол, крізь воскову стінку. У холодному методі Кіньйона нагрівання замінюють значно концентрованішою рецептурою основного барвника, а в деяких модифікованих варіантах без нагрівання додають поверхнево-активні речовини. У протоколах фарбування на кислотостійкість Американського товариства мікробіології обидві рецептури наведено поруч, і різниця в концентрації разюча: приблизно 0.3 g основного фуксину на 100 mL для методу з нагріванням проти близько 4 g для холодного методу.
Другий етап — диференціація. Кислотний спирт, зазвичай 3 mL концентрованої соляної кислоти в 97 mL 95-відсоткового етанолу, вимиває червоний барвник із кожної клітини, стінка якої не має особливої стійкості. Клітини з неушкодженою мікобактеріальною ліпідною оболонкою утримують барвник. Саме на цьому етапі ґрунтується весь метод, і саме він найбільш чутливий до техніки виконання, як описано нижче.
Останній етап — створення контрасту. Тепер на склі є червоні кислотостійкі клітини на майже безбарвному фоні клітин, що втратили барвник. Метиленовий синій у концентрації 0.3 відсотка w/v відновлює видимість цього фону, забарвлюючи його в колір, максимально відмінний від червоного. Контрастне фарбування нетривале: зазвичай від 20 до 30 секунд у методі з нагріванням і до кількох хвилин у деяких варіантах холодного методу. Тривалість визначається протоколом, а не властивостями самого барвника.
Чому цей барвник і чому синій
Метиленовий синій — катіонний основний барвник. Це означає, що його забарвлений іон має позитивний заряд і зв’язується з негативно зарядженими поверхнями знебарвлених бактерій, клітин організму-хазяїна та клітинних уламків. Підручник «Мікробіологія» OpenStax описує цю взаємодію зарядів як загальний принцип дії основних барвників. Але метиленовий синій тут не є хімічно унікальним. Кристалічний фіолетовий і сафранін також належать до основних барвників. Вибір зумовлений оптикою, а не хімією.
Для червоних паличок потрібен фон контрастного відтінку, а синій забезпечує найкорисніше протиставлення червоному у світлопольній мікроскопії. Сафранін був би невдалим контрастним барвником, оскільки його кінцевий рожево-червоний колір надто близький до кольору утриманого карболового фуксину, що знищує саме ту відмінність, яку створила процедура. Кристалічний фіолетовий дав би темно-фіолетовий фон, який конкурував би з тонкими червоними бацилами за увагу. Найпереконливіше свідчення того, що функція полягає в контрасті, а не в хімії, — можливість заміни: зелені контрастні барвники, як-от малахітовий зелений і діамантовий зелений, застосовують у деяких ветеринарних і модифікованих протоколах, і тест усе одно працює, оскільки будь-який чітко відмінний відтінок виконує ту саму функцію.
Звідси випливають два практичні наслідки. По-перше, стандартна рецептура не передбачає коригування pH; не плутайте цей звичайний водний 0.3-відсотковий розчин із лужними рецептурами, як-от метиленовий синій Леффлера, які належать до іншого принципу фарбування. По-друге, надмірність шкодить. У літературі з гістології прямо застерігають, що надто інтенсивний синій фон може приховувати поодинокі бацили, тож витримування барвника на склі довше, ніж дозволяє протокол, погіршує читабельність без жодної користі.
Хімія стінки, що робить тест можливим
Здатність кислотного спирту розрізняти клітини зумовлена мікобактеріальною оболонкою. Її структурне ядро — міколіл-арабіногалактан-пептидоглікановий комплекс: пептидоглікан, з’єднаний з арабіногалактаном, до зовнішніх кінців якого приєднані міколові кислоти з дуже довгими ланцюгами. Вони утворюють багату на ліпіди зовнішню мікомембрану з надзвичайно низькою проникністю. В огляді зовнішньої мембрани мікобактерій докладно описано цю будову. Бар’єр діє в обох напрямках. Він перешкоджає проникненню барвника, тому для цього потрібні нагрівання або концентрованіший основний барвник, і перешкоджає вилученню барвника, тому кислотний спирт не може видалити карболовий фуксин, коли той уже всередині. Звичайні бактерії не мають такої оболонки й втрачають барвник. Отже, кислотостійкість найкраще розуміти як явище ліпідного бар’єра, а не як хімічне зв’язування фуксину з міколовою кислотою.
Ця хімія також пояснює поширену загадку: мікобактерії погано й непередбачувано забарвлюються за Грамом, іноді виглядаючи як слабко забарвлені намистоподібні форми або незабарвлені клітини-привиди. Їхня гідрофобна стінка обмежує проникнення кристалічного фіолетового. Фарбування на кислотостійкість — не модифіковане фарбування за Грамом. Це інший диференційний принцип, побудований на іншій властивості стінки, як показує порівняння простого фарбування та фарбування за Грамом для двох інших методів.
Три методи, три запитання
| Метод | Виконуваний тест | Позитивний кінцевий результат | Що доводить результат |
|---|---|---|---|
| Просте фарбування (наприклад, лише метиленовим синім) | Немає; один барвник забарвлює всі клітини | Сині клітини певної форми | Лише морфологію: форму та розташування, без класифікації |
| Фарбування за Грамом | Вплив спирту або ацетону на комплекс кристалічного фіолетового з йодом | Фіолетовий (позитивний) проти рожевого (негативний) | Поведінку оболонки під час екстракції розчинником; поділ на два типи стінок |
| Фарбування на кислотостійкість | Вплив кислотного спирту на карболовий фуксин, примусово введений у воскові стінки | Червоний (кислотостійкі) проти синього (некислотостійкі) | Утримання барвника попри дію кислотного спирту; кислотостійкість, що узгоджується з наявністю мікобактерій, але не є ідентифікацією виду |
Про ширшу групу методів фарбування бактерій одним барвником див. атлас фарбування для мікроскопії.
Чого не може довести червоне на синьому
Червоні палички означають, що організми утримали карболовий фуксин після дії кислотного спирту. Така знахідка узгоджується з наявністю Mycobacterium tuberculosis, але настанови CDC з діагностики туберкульозу прямо зазначають, що інші мікобактерії також кислотостійкі. Тому для ідентифікації виду потрібні культуральне дослідження та дослідження нуклеїнових кислот, а не колір.
Помилки техніки виконання зосереджені навколо двох етапів промивання. Недостатнє знебарвлення залишає фоновий матеріал червоним і створює ризик хибнопозитивної інтерпретації. Надмірне знебарвлення видаляє слабо утримуваний основний барвник і сприяє хибнонегативним результатам. Надто інтенсивне контрастне фарбування приховує поодинокі бацили в синьому фоні. Товсті мазки, осад реагентів і забруднена вода для промивання додають власні артефакти.
Чутливість обмежена кількістю мікроорганізмів незалежно від бездоганності техніки. Для звичайної мікроскопії мазка потрібно приблизно від 5,000 до 10,000 бацил на мілілітр мокротиння, а давніші огляди доказових даних CDC оцінювали чутливість мазка приблизно від 45 до 80 відсотків серед культурально підтверджених легеневих випадків. Тому негативний мазок ніколи не виключає туберкульоз. Чинні настанови CDC передбачають культуральне дослідження поряд із кожним мазком і рекомендують тест ампліфікації нуклеїнових кислот щонайменше для одного зразка з дихальних шляхів, коли розглядають можливість легеневого туберкульозу й результат змінить тактику ведення пацієнта.
Практична робота має спиратися на затверджені протоколи
Навчальні описи, зокрема ця стаття, не є дозволом на виконання клінічної роботи. Для практичної роботи в лабораторії дотримуйтеся її валідованої стандартної операційної процедури, узгодженої з чинними документами CDC, APHL або CLSI; довідковий документ CDC щодо фарбування на кислотостійкість, що зберігається в архіві Stacks, показує, як такі процедури визначають реагенти та способи оцінювання результатів. Робота зі зразками на туберкульоз потребує заходів біологічної ізоляції: мазки готують у шафі біологічної безпеки, оскільки підготовка утворює аерозолі та бризки. Настанови CDC з лабораторної безпеки зазначають, що навіть мазки, фіксовані нагріванням, можуть містити життєздатні туберкульозні бацили, тому з ними й надалі потрібно поводитися як із контамінованими. Запис у Бібліотеці зображень громадського здоров’я CDC про мазок, забарвлений карболовим фуксином і метиленовим синім та досліджений на M. leprae, корисно нагадує про сферу застосування методу поза туберкульозом: той самий контраст червоного на синьому використовують скрізь, де шукають кислотостійкі організми, а ретельно встановлений негативний результат сам по собі вартий фіксації.
Оцінювання готового препарату
Контрастний барвник виправдовує своє застосування під час первинного перегляду. Мікроскопіст, переглядаючи препарат за малого збільшення, спочатку використовує синій фон для оцінювання якості мазка: рівномірного розподілу клітин, наявності неушкоджених клітин організму-хазяїна для фокусування, відсутності значного осаду. Потім підозрілі червоні об’єкти привертають увагу саме тому, що більше ніщо на склі не є червоним. Підтвердження проводять з олійною імерсією, за якої справжні бацили мають очікуваний вигляд тонких, іноді злегка вигнутих або намистоподібних паличок, а не однорідних частинок барвника.
Забарвлення фону також визначає формулювання висновку. Для препарату з червоними бацилами зазначають: виявлено кислотостійкі бацили, часто з напівкількісною оцінкою за шкалою лабораторії. Для препарату без червоних організмів зазначають: кислотостійких бацил не виявлено, але ніколи — негативний на туберкульоз. Це розрізнення важливе, оскільки синє поле підтверджує, що фарбування спрацювало, клітини поглинули контрастний барвник, а оптика була належною, проте нічого не говорить про організми, кількість яких нижча за межу виявлення. Порожнє синє поле — це валідний результат щодо препарату, а не висновок щодо пацієнта.
Пам’ятайте про розподіл функцій, і сформулювати висновок буде просто. Карболовий фуксин виявляє можливі цільові організми. Кислотний спирт виконує перевірку. Метиленовий синій лише робить відповідь читабельною: червоні утримали барвник попри дію кислоти, сині його втратили. Усе інше — вид, кількість мікроорганізмів і клінічне значення — встановлюють дослідженнями поза межами цього препарату.