Метиленовий синій та аутофагія: AMPK, mTOR і досліди на нейрональних клітинах

Уявіть, що ви проводите дослід на клітинах, додаєте метиленовий синій і бачите, як на блоті темнішає смуга білка LC3-II. Виникає спокуса оголосити, що сполука «посилює аутофагію», і рухатися далі. Такий висновок передчасний. Темніша смуга LC3-II може означати, що клітина утворює більше везикул для очищення, або що ці везикули накопичуються через блокування етапу утилізації. Ці два тлумачення вказують на протилежні процеси, а в літературі про метиленовий синій у нейрональних моделях є приклади доказів обох типів. У цій статті ми послідовно розглянемо, що саме вимірювали в кожному аналізі.

Макроаутофагія — досліджувана тут форма аутофагії — це механізм масового перероблення клітинних компонентів. Мембранний мішечок, який називають фагофором, розростається навколо зношених білків та органел, замикається в аутофагосому, зливається з лізосомою, а його вміст розщеплюється та вивільняється для повторного використання. Нейрони залежать від цього процесу, оскільки не діляться й не можуть зменшувати концентрацію пошкоджених компонентів шляхом поділу. Коли перероблення зупиняється, відходи накопичуються. Коли воно працює, клітина відновлює запас будівельних компонентів в умовах стресу.

Що показав один дослід на клітинах гіпокампа

У ключовому дослідженні індукції використовували клітини гіпокампа миші HT22, які піддавали стресу шляхом позбавлення сироватки протягом 24 годин. За таких умов клітини втрачають фактори росту й трофічні сигнали, що запускає як апоптоз, так і аутофагію. Дослідники повідомили, що метиленовий синій дозозалежно зменшував загибель клітин і що цей захист супроводжувався ознаками макроаутофагії.

Зміни маркерів були конкретними. Дифузне забарвлення LC3B перерозподілялося в навколоядерні точкові структури, починаючи приблизно з 20 nM метиленового синього, а найсильніша відповідь LC3-I та LC3-II спостерігалася поблизу 1 μM. Рівні як LC3B-I, так і LC3B-II зростали залежно від дози та часу. Важливо, що команда не обмежилася статичним блотом LC3. Дослідники додали 10 μM хлорохіну, який блокує лізосомне очищення, і виявили в клітинах, оброблених метиленовим синім, вищий рівень LC3-II та стабілізацію p62. Така картина свідчить на користь лізосомозалежного обігу, а не простого накопичення. Вони також показали, що хлорохін частково нівелював антиапоптотичний ефект, що пов’язує захист у цій моделі з аутофагічно-лізосомним шляхом.

Результати щодо сигналізації — та частина, яку найчастіше цитують неправильно. Сигналізація AMPK, оцінювана за фосфорильованою AMPK та її нижчерозташованою мішенню — фосфорильованою ACC, — дозозалежно посилювалася через 12 і 24 години. Інгібітор AMPK Compound C, застосований у концентрації 20 μM протягом останніх 4 годин, зменшував як фосфорилювання ACC, так і активацію LC3. Натомість виявити пригнічення фосфорильованої mTOR не вдалося. Отже, у клітинах гіпокампа за умов стресу спостерігали пов’язану з AMPK індукцію через, імовірно, mTOR-незалежний шлях. Така сама картина спостерігалася в живих мишей, у яких застосування метиленового синього індукувало маркери макроаутофагії в корі головного мозку та гіпокампі.

Індукція не означає завершеного аутофагічного потоку

Саме тут розрізнення понять має найбільше значення. Індукція означає, що початкові ланки механізму утворюють більше аутофагосом. Потік означає, що вміст проходить увесь шлях: захоплення, дозрівання, злиття з лізосомою, розщеплення, повторне використання. Будь-яке підвищення LC3-II свідчить лише про індукцію, доки тест на потік не підтвердить решту шляху.

Стандартний тест на потік вимірює LC3-II за короткочасної блокади лізосом, наприклад бафіломіцином A1 або хлорохіном, і без неї. Якщо вплив справді прискорює утворення аутофагосом, блокування їхнього руйнування має ще більше підвищити LC3-II. Тандемний репортер mCherry-GFP-LC3 дає додатковий ракурс: структури світяться жовтим до злиття з лізосомою та лише червоним після того, як кисле середовище гасить сигнал GFP. Тому більша кількість суто червоних точкових структур свідчить на користь переходу до кислих аутолізосом. Зниження рівня білка p62 може підтверджувати обіг вмісту, але з урахуванням того, що сама транскрипція p62 реагує на стрес і її слід перевіряти на рівні мРНК.

Наведений нижче перелік зіставляє кожен аналіз, використаний у цій літературі, з тим, що він вимірює і чого сам по собі довести не може. Читачі можуть застосовувати його до будь-яких майбутніх тверджень про макроаутофагію, зокрема до аргументів щодо голодування та довголіття, які спираються на ці маркери.

Зверніть увагу на одну пастку у формулюваннях, від якої застерігає таблиця. Фосфорильована ACC — це форма з пригніченою ферментативною активністю. Підвищення її рівня демонструє вихідний сигнал AMPK, а не активацію ACC.

Фраза «пригнічення макроаутофагії усунуло нейропротекцію» потребує такої самої точності. У моделі HT22 вона означає, що втручання в аутофагічно-лізосомний шлях усунуло перевагу у виживанні, яку забезпечував метиленовий синій за умов позбавлення сироватки. Це свідчить на користь необхідної або допоміжної ролі аутофагії в цій клітинній культурі. Але це не доводить, що аутофагія є єдиним захисним механізмом сполуки, і не доводить, що хлорохін діє виключно через аутофагію. Для зміцнення твердження про причинний зв’язок знадобилося б генетичне втручання в ATG5, ATG7 або ULK1.

Два шляхи до одного механізму

Спрощена схема допомагає зрозуміти процес. Енергетичний стрес підвищує активність AMPK, AMPK активує комплекс ULK1, і аутофагія починається. Фактори росту та поживні речовини підвищують активність mTORC1, mTORC1 пригнічує ULK1, і аутофагія залишається вимкненою. Нижче за ULK1 комплекс Beclin-1 і VPS34 ініціює формування фагофора, LC3-I ліпідується до LC3-II, аутофагосома замикається, зливається з лізосомою, а її вміст розщеплюється разом з обігом p62.

На схемі кожен результат для метиленового синього розміщено на відповідній ділянці: результат на клітинах гіпокампа — біля гілки AMPK, результат на клітинах-попередниках — біля гілки mTOR.

Такий підхід усуває позірну суперечність із другим дослідженням Xie. У проліферуючих нейральних клітинах-попередниках щура окремий дослід показав, що 5 μM метиленового синього пригнічували проліферацію та сприяли переходу в стан спокою: кількість Ki67-позитивних клітин зменшувалася на 1 і 3 день, тоді як уже визначена нейрональна диференціація залишалася незмінною. У цьому випадку механізм діяв через пригнічення сигналізації mTOR: зниження загального рівня mTOR і фосфорильованої mTOR поряд зі зниженням експресії p70S6K та 4EBP1, а також зменшенням експресії циклінів E1, B1, D1 і D2. Домінантним фенотипом був стан спокою клітин-попередників, який автори пов’язували з відтермінуванням клітинного старіння, а не із захистом клітин гіпокампа від стресу.

Між цими двома роботами немає суперечності. AMPK і mTOR — чутливі до контексту інтегратори, а не перемикачі з незмінною поведінкою. Нейроноподібна клітина в умовах стресу може залучати AMPK без вимірюваного пригнічення mTOR, тоді як клітина-попередник, стимульована мітогенами, може реагувати на ту саму сполуку гальмуванням mTOR-залежного механізму росту. Тип клітини, характер стресу, концентрація та момент вимірювання визначають, яка гілка домінує. Саме тому до цієї картини належать і вплив метиленового синього на мітохондріальну енергетику та окисно-відновні процеси: як описано в огляді механізмів нейропротекції, сполука діє як альтернативний переносник електронів, залучає антиоксидантну й антиапоптотичну сигналізацію, пригнічує MAO та NOS і пов’язана з оновленням мітохондрій через біогенез та аутофагію. Аутофагія — лише одна гілка плейотропного профілю дії, а не вся картина.

Чого ці досліди не показують

Позбавлення сироватки моделює трофічний і метаболічний стрес у клітинній культурі. Воно не моделює голодування цілого організму: глюкоза, амінокислоти та солі залишаються в базовому середовищі, а харчової поведінки тут немає. Концентрації в культурі від 20 nM до 5 μM не можна арифметично перерахувати в дози для людини, оскільки всмоктування, зв’язування з білками, окисно-відновний стан, метаболізм, накопичення в тканинах і тривалість впливу відрізняються.

Жодне дослідження за участю людей не було сплановане для демонстрації аутофагічного потоку, індукованого метиленовим синім у пацієнтів. Докази щодо механізмів обмежуються клітинними дослідами, роботами ex vivo та дослідженнями на тваринах, а в оглядах докази можливості перенесення результатів у клінічну практику досі описують як попередні. Отже, ці дослідження не показують, що метиленовий синій відтворює голодування, подовжує тривалість життя людини через аутофагію або забезпечує завершений аутофагічний потік у людському мозку. Твердження про імітацію голодування та довголіття потребують власних клінічних доказів, а дослідження метиленового синього за інших показань у людей не стають дослідженнями аутофагії лише через асоціацію. Читаючи дослідження моделей стресу, пов’язаного з поживними речовинами, та довголіття, слід пам’ятати про цю межу.

Читаючи наступну наукову роботу, застосовуйте перелік перевірок послідовно. Спершу з’ясуйте, яка гілка змінилася: AMPK, mTOR чи жодна. Потім перевірте, чи супроводжувався результат щодо LC3 тестом на потік, чи його отримали окремо. Далі з’ясуйте, чи усувало блокування шляху позитивний ефект і яким методом це робили. Дослідження, яке відповідає на всі три запитання, дає підстави для вагомого твердження про механізм. Те, що відповідає лише на перше, показало дозвільний сигнал, а решта шляху залишається невивченою.