Метиленовий синій і допоміжні клітини мозку: астроцити, мікроглія та запалення

Припустімо, ви проводите два експерименти з тим самим синім барвником і отримуєте два обнадійливі результати. В одній чашці зірчасті допоміжні клітини виживають після позбавлення кисню та глюкози. В іншій імунні клітини мозку зберігають спокійну розгалужену форму попри дію бактеріального токсину. Виникає спокуса об’єднати ці результати в одне твердження: барвник зменшує запалення в мозку й захищає його. Саме на цьому об’єднанні уважним читачам варто зупинитися.

У мозку є дві популяції допоміжних клітин із різними завданнями, і взаємодію метиленового синього з кожною з них досліджують за допомогою різних експериментальних чинників. Астроцити забезпечують метаболічну підтримку. Вони розташовані між кровоносними судинами й нейронами, видаляють надлишок глутамату, підтримують баланс калію, запасають глікоген і постачають нейронам енергетичні субстрати, коли потреба різко зростає. Мікроглія — це місцеві імунні наглядачі. Її тонкі відростки обстежують тканину, виявляють бактеріальні сигнали й сигнали пошкодження, а в разі тривоги втягуються, надаючи клітині округлої амебоїдної форми, пристосованої до міграції та поглинання; водночас клітина вивільняє сигнальні молекули. Результат для однієї популяції не можна переносити на іншу, а вимірювання в кожному випадку визначає, що саме було продемонстровано.

Астроцити за метаболічного стресу: головний результат — час втручання

Експеримент з астроцитами починається з позбавлення ресурсів. Дослідники культивували астроцити кори головного мозку новонароджених мишей, забирали глюкозу й майже весь кисень на шість годин, а потім відновлювали їх надходження на двадцять чотири години — це лабораторна модель інсульту з подальшою реперфузією. Коли метиленовий синій був присутній на етапі позбавлення ресурсів, виживаність клітин погіршувалася. Коли його додавали лише на етапі реоксигенації, у концентраціях 0.1 і 1 мікромоль на літр, виживаність значно покращувалася за результатами кальцеїнового тесту життєздатності. У дослідженні астроцитів мишей цю різницю залежно від часу внесення описано разом із даними про клітинне дихання.

Саме ця різниця є найважливішим результатом. Під час позбавлення ресурсів майже немає кисню, який міг би приймати електрони, тому переноснику електронів нікуди їх передавати. Під час реоксигенації клітинні механізми знову запускаються, і барвнику є що робити. Астроцити, оброблені барвником, споживали більше кисню, поглинали більше глюкози, виробляли більше АТФ і відновлювали запаси глікогену; активність гексокінази зростала, а рівень мітохондріального супероксиду не підвищувався. Запропоноване пояснення вже знайоме з опису метиленового синього як мітохондріального переносника електронів: він переносить електрони в обхід заблокованих ділянок дихального ланцюга, завдяки чому дихання відновлюється без витоку електронів з утворенням реактивних сполук.

Зверніть увагу на характер цих доказів. Це результат щодо виживаності та метаболізму одного ізольованого типу клітин, із визначеним дієвим часовим вікном — відновлення, а не позбавлення ресурсів — і визначеним діапазоном концентрацій. Він нічого не говорить ні про імунну сигналізацію, ні про поведінку.

Мікроглія за бактеріального сигналу тривоги: перепрограмування метаболізму

Експерименти з мікроглією починаються з протилежного чинника: не голодування, а хибного сигналу інфекції. Ліпополісахарид, фрагмент зовнішньої мембрани бактерій, зв’язується із сенсорами вродженого імунітету й змушує мікроглію реагувати так, ніби з’явилися патогени, хоча живих бактерій немає. У мишей, яким вводили ліпополісахарид, і в культивованій клітинній лінії мікроглії результатом стає знайома запальна програма: рівні прозапальних чинників підвищуються, мікроглія поляризується в бік агресивного стану M1, сусідні нейрони гинуть, а тварини гірше виконують завдання на навчання та пам’ять.

Дослідження цієї відповіді в мишей пов’язує її зі шляхом сприйняття кисню: ліпополісахарид спричиняє надмірну експресію PHD3, одного з трьох ферментів пролілгідроксилаз, через розташований вище в сигнальному шляху ланцюг Siah2/Morg1. Водночас клітини перебудовують енергетичний обмін у бік аеробного гліколізу з підвищенням рівня мітохондріальних активних форм кисню. Автори безпосередньо виміряли цей зсув за допомогою метаболічних аналізів Seahorse, що оцінюють споживання кисню й позаклітинне закислення. Метиленовий синій усував і метаболічний зсув, і надмірну експресію PHD3, знижував рівні запальних чинників, зменшував загибель нейронів і покращував результати поведінкових тестів. Позитронно-емісійна томографія додала дані візуалізації: ліпополісахарид підвищував поглинання глюкози гіпокампом на FDG-PET, а застосування барвника знову його знижувало, що узгоджується з менш активним запальним метаболізмом у живому мозку.

Це ширший набір вимірювань, ніж у дослідженні астроцитів: цитокіни, метаболізм, візуалізація, поведінка тварин. Але він стосується іншого чинника й іншого типу клітин. Порівнюючи ці дослідження, слід чітко розрізняти чинники: одне дослідження рятує позбавлені живлення допоміжні клітини на етапі відновлення, інше приглушує хибний сигнал інфекції в імунних клітинах.

Мікроглія під мікроскопом: форма як показник

Третій експеримент розглядає той самий бактеріальний сигнал тривоги лише через форму клітин. У гліальних культурах із кори головного мозку щурів контрольні клітини мікроглії, забарвлені на маркер IBA1, мають багато тонких відростків — розгалужену форму, характерну для нагляду за тканиною. Після двадцяти чотирьох годин дії ліпополісахариду в концентрації 10 мікрограмів на мілілітр клітини сплощуються й набувають амебоїдної форми, а площа їхнього тіла збільшується, тоді як периметр залишається приблизно сталим — це геометрична ознака округлення. Метиленовий синій у концентрації 1 мікромоль на літр, доданий одночасно з токсином, зберігав розгалужені відростки й підтримував площу тіла клітин та периметр близькими до контрольних значень. Дослідження культури клітин щурів кількісно оцінює це збереження форми за вимірюваннями площі та периметра тіла клітин.

Дві деталі роблять це дослідження вагомішим за просте зображення. По-перше, сполука порівняння — менадіон, інша окисно-відновно активна молекула в тій самій концентрації — не зберігала форму й сама спрямовувала клітини до активованої форми. Отже, цей ефект не є загальною властивістю всіх речовин, що беруть участь в окисно-відновних циклах. По-друге, автори пов’язують дію барвника з активацією Nrf2 — транскрипційного фактора, що керує програмою антиоксидантних і протизапальних генів, — а не лише з безпосереднім знешкодженням реактивних сполук. Пов’язані матеріали про окисно-відновну та запальну сигналізацію допомагають зрозуміти цей зв’язок із Nrf2 у ширшому контексті.

Проте форма залишається найменш інформативним із трьох показників. Розгалужена клітина зазвичай наглядає за тканиною, а округла зазвичай активована, але морфологія — це непрямий показник, а не транскрипт. У цій культурі не було імунних клітин із крові, нейронних мереж чи поведінкових проявів.

Порівняння трьох результатів

Спільна закономірність у цих рядках полягає в тому, що кожному чиннику відповідають власні вимірювання та власна відповідь. Метаболічне відновлення відповідає на запитання про метаболізм. Дані про цитокіни й поведінку відповідають на запитання про запалення. Форма відповідає на запитання про форму. Жоден із цих трьох результатів сам по собі не виходить за межі своєї сфери.

Чого не доводить спокійніший вигляд мікроглії

Для всієї цієї теми потрібне одне речення: менш активований вигляд мікроглії або зміна її метаболізму самі по собі не доводять покращення роботи мозку.

Морфологія може змінюватися без відповідної зміни функції. Клітина може зберігати відростки й водночас вивільняти цитокіни або округлюватися, виконуючи корисне очищення від клітинних решток. Метаболічні показники мають таке саме обмеження: крива Seahorse чи ПЕТ-зображення показують поводження з енергією, а не когнітивні функції. Дослідження на мишах, яке поєднало метаболічні та пов’язані з формою показники з поведінковими тестами, є переконливішим саме тому, що об’єднало кілька рівнів доказів, а не поклало весь висновок на одне вимірювання. Навіть тут діють звичайні обмеження: ліпополісахарид моделює стерильний сигнал тривоги, а не справжню інфекцію, миші — не люди, і самі автори вказують на міжвидові відмінності. Усім, хто планує подальші дослідження, варто оцінити, наскільки результати щодо мікроглії можна переносити між моделями, перш ніж припускати, що цей шлях поводиться так само в людській тканині.

Звідси випливає практичний наслідок щодо часу введення. У дослідженні астроцитів раннє введення погіршувало результат, а введення під час відновлення — покращувало. Результати для мікроглії отримані за введення приблизно в момент дії запального чинника. У реальному житті пошкодження мозку одночасно поєднує обидві фази: порушення енергозабезпечення та імунний сигнал тривоги, які розвиваються протягом годин. Експеримент, що ізолює одну фазу, не може визначити графік введення для їх поєднання. Саме тому під час обговорення часових вікон введення часові перебіги позбавлення ресурсів і запалення розглядають окремо.

Чесний підсумок уміщується в одному абзаці. В ізольованих астроцитах метиленовий синій, доданий під час реоксигенації, відновлює дихання й рятує клітини. У мікроглії, на яку діє бактеріальний фрагмент, він усуває запальну метаболічну програму через конкретний шлях PHD3 і зберігає форму стану спокою. Кожен результат справедливий у межах умов свого експерименту, і жоден не є загальним висновком щодо запалення в мозку. Порівняння гліальних клітин корисне саме тим, що не дає цим двом історіям злитися в одну.