Метиленовий синій як індикатор анаеробних умов і кисню: що доводить зміна кольору

Лаборантка герметично закриває анаеробну ємність, перевіряє індикаторну смужку з метиленовим синім крізь кришку й бачить те, що хоче побачити. Смужка із синьої стала білою. Вона записує, що цикл відбувається в анаеробних умовах, і переходить до інших справ. Через два дні на одній чашці немає росту, тоді як у герметично закритій пробірці з бульйоном у тій самій ємності помітні ознаки впливу кисню. Смужка показувала правду. Лаборантка поставила їй не те запитання.

Причина плутанини — у змішуванні понять. Індикатор анаеробних умов із метиленовим синім пов’язаний з окисно-відновними процесами, а не зі стерильністю чи валідацією всієї системи. Щойно ця відмінність стає зрозумілою, смужка перетворюється на точний і надійний інструмент із вузьким призначенням.

Принцип: оборотна окисно-відновна пара

Розчинений метиленовий синій існує у двох станах. Окиснена форма — це знайомий синій катіон. Відновлена форма, яку називають лейкометиленовим синім, безбарвна. За близького до нейтрального pH спрощена напівреакція виглядає так: один синій катіон плюс один протон плюс два електрони утворюють одну безбарвну молекулу лейкоформи. Формальний потенціал становить близько плюс 11 мілівольт відносно стандартного водневого електрода за pH 7. Це діапазон, якого можуть досягати багато відновних систем і в якому кисень може спричинити зворотне перетворення.

Для відновлення потрібен низький локальний окисно-відновний потенціал. Самого лише видалення кисню не завжди достатньо. У ранніх дослідженнях анаеробних умов виявили, що метиленовий синій у звичайній воді без кисню зберігав колір, якщо не було відновної речовини, а суміші декстрозного бульйону з приблизно 0.01 відсотка барвника легко знебарвлювалися за 37 C, тоді як та сама суміш за 4 C залишалася синьою протягом доби. Про це повідомлено в дослідах зі свіжими тканинами та умовами анаеробного культивування. Температура, pH, глюкоза, аскорбат, тіогліколят і відновна активність мікроорганізмів визначають, чи будуть доступні електрони.

Для повторного окиснення потрібен лише кисень. Коли повітря досягає лейкоформи, вона знову стає синьою. Сучасні спеціально розроблені індикатори використовують саме цей цикл: барвник плюс відновник плюс стабілізувальна матриця; за низького вмісту кисню індикатор безбарвний, а під дією повітря знову синіє. Це продемонстровано в гібридному кисневому індикаторі з метиленовим синім на основі барвника, відновника, поверхнево-активної речовини та глини. У цьому прототипі використовували 0.01 мілімоля на літр барвника з 2.0 мілімоля на літр аскорбату або глюкози за pH 11. Він ставав безбарвним за вмісту кисню близько 0.5 об’ємного відсотка та розрізняв концентрації кисню нижче 0.1 відсотка й вище 0.5 відсотка у своїй випробувальній камері.

Отже, принцип роботи простий. Синій колір означає, що індикаторна зона окиснена. Безбарвність означає, що в індикаторній зоні встановилися відновні умови з низьким вмістом кисню. Зміна оборотна, локальна й хімічна. Сама по собі вона нічого не говорить про мікроорганізми.

Як працює індикаторна смужка з метиленовим синім в анаеробній ємності

Індикаторна смужка з метиленовим синім для анаеробної ємності — це невелика реакційна зона, розміщена в газовому середовищі ємності так, щоб її було видно без відкривання. Комерційні формати різняться: паперові смужки, таблетки, які розчиняють або змочують під час підготовки, та новіші гібридні паперові індикатори. Деяким для активації реакційної зони потрібна одна крапля дистильованої води. Інші мають сухий формат і повинні залишатися сухими. Керуватися слід інструкцією до конкретного виробу, адже зволоження, розміщення й час зчитування є частиною хімічного процесу.

На практиці передбачене тлумачення має два варіанти. Синій колір означає, що біля смужки зберігається кисень або недостатньо відновні умови. Білий колір чи безбарвність означають, що біля смужки встановилися анаеробні окисно-відновні умови. До деяких комерційних паперових індикаторів додають червоний фоновий пігмент, тому у відновленому кінцевому стані вони рожеві, а не білі. Перш ніж оцінювати індикатор, з’ясуйте, який кінцевий колір передбачено для вашого виробу.

Час залежить від системи. В одній системі типу GasPak знебарвлення починалося приблизно протягом години й завершувалося за кілька годин, тоді як у контрольованому порівняльному дослідженні за кімнатної температури метиленовому синьому знадобилося понад шість годин. Окисно-відновний потенціал середовищ у тій роботі досягав приблизно мінус 100 мілівольт протягом 60–100 хвилин, задовго до завершення зміни кольору барвника, а на момент повного знебарвлення смужки був значно нижчим за мінус 200 мілівольт. Індикатор реагує із затримкою відносно змін у газовому середовищі. Синя смужка через одну годину не доводить невдачу, а біла смужка через шість годин описує стан смужки саме через шість годин.

З тієї самої причини важливе розміщення. Тримайте смужку в газовому просторі над вмістом ємності, у полі зору крізь кришку, подалі від поверхонь агару та культуральних середовищ. Вона показує стан свого безпосереднього оточення. Якщо притиснути її до холодної стінки, сховати під чашками або дати їй просочитися конденсатом, вона показуватиме стан цього мікросередовища, а не ємності загалом.

Що показує смужка, а чого не показує

Сприймайте індикатор із метиленовим синім для анаеробної ємності як один датчик в одному місці. Він засвідчує локальні окисно-відновні умови та вміст кисню у власній реакційній зоні, які загалом відображають стан газового простору за достатнього перемішування й встановлення рівноваги. Усе поза цим — висновки, а для висновків потрібні окремі докази.

Безбарвна смужка не підтверджує стерильність. Стерильність — це відсутність життєздатних організмів, доведена валідованою стерилізацією та контрольними перевірками культивування. Ємність може бути повністю анаеробною й водночас забрудненою або повністю стерильною й водночас аеробною.

Вона не підтверджує належні умови в кожній частині системи культивування. Розчинений кисень у герметично закритій пробірці, кисень у глибині агару, градієнти в щільно завантаженій ємності та порушення герметичності після зчитування — усе це залишається поза можливостями однієї смужки. Досліди з просторовим розподілом показали сусідні сині й безбарвні зони в одній посудині, де проникнення кисню та відновна активність урівноважувалися по-різному. Одна точка не може підтвердити умови в усьому об’ємі.

Вона не доводить безперервність анаеробних умов. Показання смужки, зчитане один раз під час підготовки, нічого не говорить про двадцяту годину. У сучасних роботах із контролю якості анаеробних умов застерігають, що хімічні індикатори описують газове середовище в момент зчитування та можуть виглядати задовільно, попри невелику кількість залишкового кисню. Зв’язок між показаннями смужки та перебігом інкубації забезпечує безперервне документування або записи в контрольні моменти, а не одноразовий погляд наприкінці.

Докладніше про хімію зміни кольору читайте в матеріалі про те, як метиленовий синій переходить між окисненим і відновленим станами. Про ширший вплив кисню на роботу зі зразками дивіться матеріал про контроль кисню в мікроскопії та культивуванні.

Схема, яку варто тримати біля ємності

Наведений нижче рисунок стисло подає зміст статті як одну пам’ятку для лабораторного столу. Три стани тієї самої смужки, два напрями реакції та межа між показаннями індикатора й валідацією системи.

Причини збоїв, через які смужка залишається синьою або хибно заспокоює

Більшість збоїв належать до п’яти груп. Кожна має характерні ознаки.

Негерметична ємність або пакет постійно пропускає кисень до реакційної зони. Смужка залишається синьою або знову синіє після знебарвлення. Перш ніж звинувачувати хімію, перевірте кришку, ущільнювач, затискачі та ущільнювальні поверхні.

Вичерпаний або неправильно активований газогенератор не видаляє кисень. У старих системах, що активувалися водою, відсутність конденсату приблизно через 10–15 хвилин і нагрівання кришки приблизно через 20–40 хвилин були ранніми попереджувальними ознаками саме для такої системи. Пакетик недостатньої потужності в перевантаженій ємності дає такий самий збій.

Проблема отруєного каталізатора стосується лише старих систем із воднем і паладієм, де паладій сприяє утворенню води з водню та кисню. Волога й сірководень погіршують його роботу. Багато сучасних пакетиків узагалі не використовують паладію, тому не застосовуйте цей спосіб усунення проблеми там, де він недоречний.

Деградована смужка або смужка, з якою неправильно поводилися, може вийти з ладу без явних ознак. Під час зберігання барвник і відновник втрачають здатність до оборотного перетворення. Це одна з причин розроблення гібридних складів, стійких до вицвітання під дією світла та втрати властивостей під час зберігання. Відбраковуйте прострочені вироби, вироби з ненормальним початковим кольором, а також смужки, які змочили, хоча вони мали залишатися сухими, або залишили сухими, хоча вони потребують змочування.

Градієнт або затримка вводять в оману того, хто зчитує показання, а не порушують хімічний процес. Погано перемішаний газовий простір, герметично закриті пробірки з розчиненим киснем і напівтверді середовища зберігають власні умови довше, ніж може здатися за показаннями смужки. Резазуринові смужки проходять через рожевий стан до безбарвного й часто рекламуються як швидші, але їхні порогові значення залежать від власного складу й не поширюються на метиленовий синій.

Контролі та протокол зчитування, який варто взяти за зразок

Два недорогі контролі виявляють більшість помилок тлумачення. Під час циклу тримайте поруч свіжу контрольну смужку на кімнатному повітрі. Справна смужка з метиленовим синім залишається там синьою. Деякі упаковані індикатори спочатку бліді й синіють після відкривання, що саме по собі є перевіркою працездатності. Також періодично розміщуйте свіжу смужку в попередньо валідованій анаеробній системі. Вона має досягти валідованого кінцевого відновленого стану протягом часу, зазначеного для виробу. Якщо будь-який із контролів поводиться не так, як очікується, замініть партію, перш ніж довіряти показанням у ємності.

Протокол зчитування випливає з механізму роботи. Розмістіть смужку в газовому просторі так, щоб її було видно без відкривання ємності, дотримуючись інструкції до виробу щодо контакту зі стінкою та змочування. Запишіть початковий колір, час герметичного закриття ємності й колір у контрольний момент, зазначений для виробу. Якщо конструкція ємності дозволяє, фіксуйте, що індикатор залишався відновленим у визначені контрольні моменти під час інкубації. Запишіть кінцевий колір безпосередньо перед відкриванням. Саме колір до відкривання є кінцевим показанням для цього циклу. Після відкривання очікуйте повторного посиніння й не дозволяйте йому змінювати попередні висновки.

Якщо смужка залишається синьою після зазначеного часу, вважайте анаеробні умови непідтвердженими. Послідовно перевіряйте весь ланцюжок: герметичність, пакетик, каталізатор, якщо він є, зволоження індикатора та термін придатності, а потім працездатність індикатора шляхом порівняння з контролем на повітрі. Лише після підтвердження належного газового середовища слід тлумачити наявність або відсутність росту, використовуючи систему анаеробного культивування та контрольні мікроорганізми, що відповідають конкретному застосуванню.

У межах власного призначення смужка заслуговує на останнє слово. Синя чи безбарвна, вона відповідає на одне запитання про одне місце в один момент часу. Ставте їй це запитання за графіком і з контролями поруч — і вона відповідатиме надійно. Запитуйте її про стерильність, про кожну пробірку або про всю інкубацію на підставі одного погляду — і жодна індикаторна хімія не врятує таке тлумачення.