Фарбування клітин щоки метиленовим синім: що спостерігати

Учениця наносить краплю суспензії клітин щоки на предметне скло, дивиться в мікроскоп і майже нічого не бачить. У світлому полі пливуть кілька блідих примар. Вона підлаштовує фокус, потім додає світла й зрештою вирішує, що скло порожнє. Але воно не порожнє. Клітини там є. Вони майже прозорі, і саме цю проблему має розв’язати фарбування.

Цю невідповідність між очікуванням і зображенням варто пояснити ще до початку роботи за протоколом. Початківці очікують, що мікроскоп покаже деталі так само, як зум камери дає змогу роздивитися далекий напис. Мікроскоп світлого поля виконує вужче завдання: показує відмінності в поглинанні світла. Нефарбована клітина щоки майже не поглинає світла, тому майже не створює таких відмінностей. Метиленовий синій додає їх. Він нерівномірно зв’язується всередині клітини й перетворює структуру на контраст. Щойно учні зрозуміють цю ідею, кожен наступний крок сприйматиметься як її наслідок, а не просто пункт інструкції.

Тут допоможуть базові знання про те, як просте фарбування створює контраст у шкільній лабораторії, а повторення налаштування мікроскопа світлого поля перед фарбуванням дасть змогу уникнути половини невдалих препаратів. Хімію цього забарвлення пояснює вступ до застосування метиленового синього в мікроскопії, де розглянуто, чому саме цей барвник так часто використовують у лабораторії.

Навчальний протокол

Наведений нижче варіант вологого препарату — простіший стандартний вибір для загальних занять. Він не потребує ані полум’я, ані етапу фіксації. Варіант із фіксованим мазком, який використовують у деяких посібниках для коледжів, додатково передбачає висушування на повітрі та коротку теплову фіксацію, як у практичній роботі з мазком зі щоки коледжу North Central Texas College, опублікованій на Biology LibreTexts, проте теплова фіксація — це звична практика в мікробіології, а не обов’язкова умова для спостереження епітеліальних клітин.

Що знадобиться: чисті предметні й покривні скельця, стерильні одноразові тампони (бажано) або нові пласкі зубочистки, флакон-крапельниця з водним розчином метиленового синього концентрацією від 0.5 до 1 відсотка, дистильована або деіонізована вода, промокальний папір, рукавички та складний світловий мікроскоп із загальним збільшенням 100x і 400x.

1. Прополощіть рот звичайною водою. Це видаляє частинки їжі, які згодом інтенсивно забарвлюються й відволікають увагу від клітин.
2. Кожен учень бере зразок лише з власної щоки. Обережно проведіть новим стерильним тампоном по внутрішній поверхні щоки. Притискайте, не шкребіть. Припиніть задовго до появи будь-якого дискомфорту чи кровотечі.
3. Прокотіть тампон по центру чистого предметного скла, залишаючи тонкий шар. Тонка плівка — найважливіша умова отримання препарату, який можна роздивитися. Товстий білий шар після фарбування перетвориться на синю масу, у якій нічого не розрізнити.
4. Нанесіть на мазок одну краплю метиленового синього. Залиште на 1–3 хвилини. У багатьох протоколах для коледжів достатньо однієї хвилини; у посібнику з лабораторних робіт із природничих наук NCERT для IX класу для тимчасового препарату відведено близько 3 хвилин. Довше не означає краще, а надмірне фарбування — найпоширеніша помилка у виборі часу.
5. Обережно промийте дистильованою водою або відведіть надлишок барвника промокальним папером відповідно до місцевого протоколу. Тло має стати блідо-блакитним, а не насиченим темно-синім.
6. Опускайте покривне скельце під кутом так, щоб спочатку торкнувся один край, а потім повільно опустіть решту. Це запобігає утворенню бульбашок повітря.
7. Почніть із малого збільшення, щоб знайти клітини, перевірити фокусування й розташування в центрі поля зору, потім перейдіть до 100x і насамкінець до 400x. При 400x використовуйте лише точне фокусування.

Концентрація барвника потребує короткого уточнення. У шкільних протоколах зазвичай використовують приблизно 1-відсотковий водний розчин метиленового синього. Концентрованіший вихідний розчин або триваліша витримка швидше посилюють забарвлення тла, ніж ядра, і це порушує контраст, на якому ґрунтується ця робота.

Безпечне поводження з матеріалом зі щоки

Зразки зі щоки містять слину та звичайні мікроорганізми ротової порожнини, тому поводьтеся з кожним свіжим мазком як із потенційно інфекційним матеріалом, навіть якщо його надали здорові однокласники. У настановах Американського товариства мікробіології з біобезпеки в навчальних лабораторіях наведено загальні принципи: оцінити ризики перед заняттям, носити рукавички, захищати очі там, де можливі бризки, після роботи мити руки, дезінфікувати робочі поверхні та утилізувати забруднені одноразові матеріали за затвердженою процедурою для біологічних відходів.

Чотири правила для занять охоплюють більшість ризиків. Один донор на тампон і на предметне скло; ніколи не користуйтеся ними спільно. Зразки беруть лише в себе, ніколи не в сусіда. Одноразові тампони й зубочистки одразу потрапляють до призначеного контейнера для відходів, а не назад на робочий стіл. Сам метиленовий синій забарвлює шкіру й одяг та подразнює очі, тому потрібні рукавички й звичайні правила гігієни під час роботи з барвниками. Не розширюйте цю роботу до культивування будь-чого з мазка й не імпровізуйте з тепловою фіксацією свіжого людського матеріалу поза шкільною процедурою безпеки.

Що спостерігати й чому це має такий вигляд

При 100x шукайте широкі пласкі клітини блідо-блакитного кольору з нерівними овальними або багатокутними контурами. Вони лежать поодинці або утворюють пухкі пласти, у яких перекривають одна одну. У кожній клітині зазвичай є одна темніша синя пляма. Це ядро. Зверніть увагу й на розташування: клітини плоского епітелію схожі на тонкі плитки, а не на кулі, тому їхні краї нагадують потріскану глазур, а не круглі повітряні кульки.

При 400x чітко розрізняються три ознаки. Межа клітини виглядає як тонка темніша лінія, що її оточує. Цитоплазма заповнює внутрішній простір рівномірним світло-блакитним кольором. Ядро темніше й компактніше, часто овальне, зазвичай поблизу центру, але не завжди. Попросіть учнів зафіксувати всі три ознаки, а також форму клітини й збільшення, адже саме цього вимагає робочий аркуш.

Тут важливе одне уточнення, яке в багатьох робочих аркушах подають неправильно. Видима межа відповідає ділянці плазматичної мембрани, але сама мембрана — ліпідний бішар завтовшки приблизно від 7 до 10 нанометрів — значно тонша за межу роздільної здатності шкільного мікроскопа. Учні бачать оптичний край клітини та накопичений там барвник. Те саме застереження стосується органел. Мітохондрії, ендоплазматична сітка, апарат Гольджі та рибосоми в цьому препараті не видимі. За добрих умов звичайний світловий мікроскоп розрізняє деталі розміром приблизно від 0.2 мікрометра, як пояснює матеріал NCBI з клітинної біології про інструменти мікроскопії, а більшість ультраструктурних деталей лежать нижче цієї межі або поблизу неї. Подальше порожнє збільшення робить зображення більшим, не додаючи деталей.

Чому ядро забарвлюється найтемніше? Метиленовий синій — катіонний барвник, позитивно заряджений у розчині, який взаємодіє з негативно зарядженими компонентами клітини, насамперед із нуклеїновими кислотами. Хроматин зосереджує ДНК у ядрі, тому ядро накопичує найбільше барвника. Цитоплазма містить РНК та інші заряджені молекули, тому також забарвлюється, але більш дифузно й світліше. Важливе уточнення: метиленовий синій не є специфічним барвником для ДНК. У роботі про розподіл метиленового синього під час візуалізації ядер описано взаємодію катіона з ділянками, багатими на нуклеїнові кислоти, а в давнішому кількісному дослідженні зв’язування метиленового синього в клітинних препаратах виявлено, що більша частина зв’язаного барвника пов’язана з нуклеїновими кислотами. Отже, темне ядро на тлі світлої цитоплазми — це картина контрасту, а не молекулярний аналіз.

Помилки учнів і як їх розпізнавати

Майже кожен невдалий препарат відповідає одному з п’яти типових випадків. Навчіть учнів визначати проблему препарату, а не сліпо повторювати роботу.

Надмірне фарбування робить клітини й тло однаково темними, тому ядро зливається з полем зору. Виправте це, скоротивши час фарбування або ретельніше промивши препарат. Недостатнє фарбування залишає примарні клітини, які зникають, коли освітлення посилюють; збільшуйте час із кроком у тридцять секунд. Товсті мазки утворюють щільні маси клітин, що перекривають одна одну, і жодного контуру не можна простежити; виправлення тут механічне: наступного разу розподіліть матеріал тоншим шаром, адже жодне промивання не врятує купу клітин. Бульбашки повітря виглядають як ідеальні кола з чіткими темними обідками й відволікають початківців, які помилково вважають їх структурами; повторно накладіть покривне скельце повільно й під кутом. Крихітні темні крапки, розсіяні на клітинах або навколо них, зазвичай є звичайними бактеріями ротової порожнини, як зазначено в шкільних протоколах, зокрема в методиці дослідження клітин щоки Ingrid Science. Вони підтверджують, що в роті живуть мікроорганізми, і це може запам’ятатися учням, але в межах цієї роботи неможливо визначити їхній вид, і їх не слід малювати як частини клітини. Рештки їжі та нитки слизу забарвлюються нерівномірно й інтенсивно; попереднє полоскання потрібне, щоб зменшити їхню кількість.

Чого ця робота не дає змоги зробити

Це навчальне спостереження, а не діагностичний тест. Жодні особливості вигляду клітин у навчальному забарвленому препараті не дають змоги діагностувати інфекцію, рак чи будь-яке захворювання, і статтю не слід розуміти як твердження про протилежне. Препарат показує форму, межу, цитоплазму та ядро при двох збільшеннях. Він не показує ультраструктуру мембрани, деталі органел або молекулярну ідентичність. Чітке визначення цього обмеження захищає і наукову коректність, і учнів: добрий результат — це правильно підписаний малюнок із зазначенням збільшення та барвника, а не висновок про здоров’я.

Робочий аркуш для учнів і мікрофотографії з підписами

Два матеріали проєкту для цієї сторінки — мікрофотографія з підписами вище та робочий аркуш нижче. Роздрукуйте по одному аркушу для кожного учня або покажіть його на екрані й попросіть учнів перенести поля в зошити.

Як використати його на 45-хвилинному занятті: десять хвилин на інструктаж із безпеки та відбір зразків, десять хвилин на фарбування й виготовлення препарату, п’ятнадцять хвилин на спостереження та замальовки при обох збільшеннях, десять хвилин на контрольний список і порівняння з мікрофотографією з підписами. Пункти контрольного списку навмисно прості й конкретні. Тонкий мазок, правильний час фарбування, ядро темніше за цитоплазму, збільшення записане. Учень, який може позначити всі чотири пункти, зрозумів ідею, заради якої проводять цей урок: мікроскопи показують відмінності, а барвники створюють ті відмінності, які варто побачити.