Мәкалә
Микроскопия өчен метилен зәңгәренә альтернативалар: бурычка карап сайлагыз
Гади бактерия мазогы өчен, максат күзәнәк формасын күрү булса, метилен зәңгәрен кристалл виолет белән алыштырырга мөмкин. Тере күзәнәкләр өчен иң яхшы альтернатива бөтенләй буяусыз фазалы контраст булырга мөмкин. Сайлау сезгә нинди күзәтү үткәрергә кирәклегенә бәйле.
Бер үк бактерия культурасын ике кеше тикшерә дип күз алдына китерик. Берсе таякчык формасындагы күзәнәкләрне түгәрәк күзәнәкләрдән аерырга тели. Икенчесе эшкәртү бактерияләрне үтергәнме-юкмы икәнен белергә тели. Беренче кешегә ачык сурәт биргән буяу икенчесенә файдалы җавап бирмәскә мөмкин.
Алмаштыргыч сайлаганчы, бу җөмләне тәмамлагыз: “Миңа ___ эчендә ___ күзәтергә кирәк, һәм күзәнәкләр тере калырга тиеш / тиеш түгел.” Бу җөмлә буяу башкарырга тиешле бурычны билгели.
Үрнәктән һәм сораудан башлагыз
Башта күзәнәкләрнең тере калырга тиешме-юкмы икәнен билгеләгез, аннары күзәтергә кирәкле үзенчәлекне ачыклагыз:
- Күзәнәкләр тере калырга тиеш: хәрәкәт яки форма өчен буяусыз фазалы контраст яки DIC карагыз; төш ДНКсы өчен флуоресценция белән Hoechst 33342 карагыз; мембрана бөтенлеге өчен SYTO 9 һәм propidium iodide кебек расланган анализны сайлагыз.
- Күзәнәкләрнең тере калуы кирәк түгел: бактерия морфологиясе өчен кристалл-виолет белән гади буяу яки нигрозин белән негатив буяу карагыз; Грам реакциясе өчен тулы Грам буяу ысулын кулланыгыз; фиксацияләнгән күзәнәкләрдә төш ДНКсы өчен DAPI флуоресценциясен карагыз.
Һәр тармакның чикләүләрен чагыштыру өчен бу таблицаны кулланыгыз. Болар — гамәлдәге протокол эчендә шешәләрне алыштыру күрсәтмәләре түгел, ә ысул сайлау вариантлары.
| Нәрсәне күзәтергә кирәк | Үрнәк һәм җиһаз | Мөмкин булган альтернатива | Төп чикләү |
|---|---|---|---|
| Бактерияләрнең формасы һәм урнашуы | Әзерләнгән бактерия мазогы; якты кыр | Кристалл виолет белән гади буяу | Морфологияне күрсәтә; Грам реакциясен яки тереклекне билгеләми. |
| Караңгы фондагы күзәнәк контурлары | Бактериологик препарат; якты кыр | Нигрозин белән негатив буяу | Препарат әзерләү һәм состав әһәмиятле; буялмаган күзәнәкнең тере булуы мәҗбүри түгел. |
| Грам реакциясе | Әзерләнгән бактерия мазогы; якты кыр | Тулы Грам буяу ысулы | Реагентларның тулы эзлеклелеген һәм контрольләрне таләп итә. |
| Тере күзәнәкләрнең хәрәкәте яки үзгәрешләре | Яраклы дымлы препарат; фазалы контраст яки DIC | Буяусыз | Тиешле оптиканы таләп итә; контраст молекуланы идентификацияләми. |
| Төш ДНКсы | Фиксацияләнгән күзәнәкләр; флуоресценция | DAPI | Яраклы кузгату һәм эмиссия фильтрларын таләп итә. |
| Тере күзәнәкләрдә төш ДНКсы | Тере күзәнәкләр; флуоресценция | Hoechst 33342 | Күзәнәккә үтеп керү сурәтләү шартларының зыянсыз булуын расламый. |
| Бактерия мембранасының бөтенлеге | Фиксацияләнмәгән бактерияләр; флуоресценция | SYTO 9 һәм propidium iodide | Мембрана буялуы — тереклекнең турыдан-туры булмаган күрсәткече. |
Гади мазок өчен ысулны саклык белән алыштырыгыз
Бурыч бактерия морфологиясен бер төстә күрү булганда, кристалл виолет — практик вариант. FDA-ның Бактериологик аналитик кулланмасында гади буяу өчен яраклы ике кристалл-виолет составы күрсәтелгән. Документлаштырылган составны һәм аның әзерләү ысулын кулланыгыз; буяуның исеме генә эш реагентының составын билгеләми.
Кристалл виолет Грам буяуда да кулланыла, ләкин бу кристалл-виолет белән гади буяуны Грам буявына әйләндерми. ASM Грам буяу протоколында дифференциаль нәтиҗә кристалл виолет, йод, төссезләндерү һәм контрбуяуның эзлекле эшләвенә бәйле. Бу этапларны төшереп калдыру сурәттән нинди нәтиҗә чыгарырга мөмкин булуын үзгәртә. Бу аерма турында гади буяу һәм Грам буяуны чагыштыру мәкаләсен карагыз.
Нигрозин контурларны күрсәтүнең башка ысулын тәкъдим итә: ул фонны караңгылата, ә бактерия күзәнәкләре чагыштырмача якты булып кала. Merck-ның нигрозин буенча күрсәтмәләрендә гомуми алмаштыргычлар исемлегендә игътибардан читтә калырга мөмкин булган мөһим деталь бар. Күрсәтелгән эш составына формальдегид керә. Шуңа күрә, күзәнәкләр үзләре буялмаган булып күренсә дә, “негатив буяу” сүзләреннән тере күзәнәкләр белән ярашлылык турында нәтиҗә ясап булмый. Тулы составны һәм үрнәк әзерләү ысулын тикшерегез.
Тере үрнәкләр өчен оптиканы үзгәртүне карагыз
Күзәнәкләрнең хәрәкәтен яки бүленүен күзәтергә теләсәгез, башка буяу өстәү күзәтүне катлауландырырга мөмкин. Nikon үтә күренмәле үрнәкләрдә контраст буенча кулланмасында аңлатканча, фазалы контраст һәм дифференциаль интерференцион контраст, яки DIC, үрнәкләрне аларның оптик үзлекләрендәге аермалар ярдәмендә күренерлек итә. Микроскопта кирәкле компонентлар булса, алар тере, буялмаган күзәнәкләрне күрсәтә ала.
Бу сайлау препаратны буялмаган килеш саклый, ләкин алырга мөмкин булган мәгълүматны үзгәртә. Контрастны кайсы молекула тудырганын белмичә дә чикне яки хәрәкәтне күзәтергә мөмкин. Әгәр сорау молекуляр локализация турында булса, тиешле тамгалау ысулын сайлагыз.
Төш ДНКсы өчен Invitrogen-ның DAPI һәм Hoechst буяуларын чагыштыруы DAPI-ның фиксацияләнгән күзәнәкләрдә киң кулланылуын һәм күзәнәк мембранасы аша яхшырак үтүче Hoechst 33342-нең тере күзәнәкләрне тамгалау өчен өстенлекле булуын аера. Икесе дә флуоресценция җиһазын таләп итә. Аларның берсе дә якты кыр өчен төсле буяуны турыдан-туры алыштырмый.
Буяуга тәэсир итүне һәм яктыртуны эксперимент шартлары итеп карагыз. Күзәнәкләрнең үз-үзен тотышын үлчисез икән, буялган һәм буялмаган препаратларны чагыштырыгыз.
Кызыл күзәнәк автомат рәвештә үле күзәнәк дигән сүз түгел
SYTO 9 һәм propidium iodide бактерия мембранасының бөтенлеген бәяләү өчен еш кына бергә кулланыла. BacLight кулланмасы бөтен мембраналарны яшел буялу, ә зарарланган мембраналарны кызыл буялу белән бәйли. Бу аңлатманы конкрет үрнәк өчен расларга кирәк.
Розенберг һәм хезмәттәшләренең 2019 елгы тикшеренүе проблеманы күрсәтә. Фосфат-буферлы тозлы эремәдә пыялада үстерелгән 24 сәгатьлек E. coli биопленкаларында күзәнәкләрнең якынча 96%ы урыннында propidium iodide-позитив булып күренгән. Әмма авторлар җыеп алганнан соң аларның 82%ы культивацияләнә ала дип бәяләгән. Конфокаль сурәтләр кызылга буялган материал астында эчке өлеше яшел булган күзәнәкләрне күрсәткән, бу ялгыш сигналга күзәнәктән тыш нуклеин кислоталарының өлеш кертүен күрсәтә.
Бу процентлар универсаль төзәтмә коэффициентын түгел, ә тикшеренүдәге препаратларда төрле үлчәүләрне тасвирлый. Практик нәтиҗә — сигналны нәрсә тудырганын тикшерү. Биопленкада нуклеин кислотасы буявы зарарланган күзәнәкләр эчендәге материалны гына түгел, күзәнәкләрдән тыш материалны да ачыклый ала. Тереклек турында нәтиҗә өчен тикшерүчеләр культивация яки метаболик активлык кебек өстәмә үлчәүләр тәкъдим итә, шул ук вакытта һәркайсының чикләүләре барлыгын искәртә.
Альтернативаның чынлыкта нәрсәдән торуын тикшерегез
Альтернатив буяу ысулында да метилен зәңгәр булырга мөмкин. Giemsa — шундый мисал: Merck үз продуктын azure-eosin-methylene-blue эремәсе дип тасвирлый; ул, шул исәптән, кан һәм сөяк чылбыры мазоклары өчен кулланырга билгеләнгән. Бу башка үрнәк өчен башка ысул булырга мөмкин, ләкин метилен зәңгәрен тулысынча чыгару таләбен үтәми.
Әгәр кушылманы чыгару экспериментның бер өлеше булса, сурәтләрне чагыштырганчы реагентның кемлеген һәм составын тикшерегез. Methyl blue, methylene blue һәм исемнәре охшаш буяулар турында кулланма атамалардагы аермаларны аңлата.
Нәтиҗәне кулланганчы алмаштыруны тикшерегез
Яңа ысул өчен репрезентатив үрнәкләр һәм тиешле контроль кулланып кечкенә чагыштыру ясагыз. Мөмкин булганча, микроскоп көйләүләрен чагыштырырлык итеп саклагыз. Яхшырак күренгән сурәтне бары тик өстен күрү урынына тикшерергә мөмкин булсын өчен, реагент составын, үрнәк әзерләүне, тәэсир итүне һәм сурәтләү шартларын теркәгез.
Уңышны баштагы сорауга карап бәяләгез. Морфология өчен күзәнәк чикләре һәм урнашу тәртибе аңлаешлы булып каламы — шуны бәяләгез. Төшне тамгалау өчен сигналның урнашуын һәм фонны бәяләгез. Тереклек өчен матур төсләр аерылуыннан тыш дәлилләр таләп итегез. Метилен зәңгәр белән буяу һәм лабораториядә куллану буенча киңрәк кулланма күзәтү белән препарат әзерләүнең ничек бәйләнгәнен аңлата.
Сезгә кирәкле үлчәүне саклап кала торган альтернативаны сайлагыз. Төс — нәтиҗәдәге сурәтнең бары тик бер үзлеге.