Метилен зәңгәре митохондриянең III комплексын читләтеп уза аламы? Тикшеренүләр нигә бер фикергә килми

Ике лаборатория метилен зәңгәренең блокланган митохондриаль III комплексны читләтеп уза алуын тикшергән. Берсе «юк» дип җавап биргән. Икенчесе — «әйе» дип. Икесенең дә мәгълүматлары булган.

Тычкан миенең митохондрияләрендә үткәрелгән беренче тикшеренү буягычның моны эшли алмавын күрсәткән. Өч төр кимерүченең ми митохондрияләрендәге икенче тикшеренү аның моны өлешчә эшли алуын ачыклаган. Тычкан бавырында үткәрелгән өченче тикшеренүне дә еш кына шулар янында телгә алалар, ләкин ул башка нәрсәне сынаган. Аны үз урынына куйсак, буталчыклыкның яртысы бетә.

Монда игълан итәрлек универсаль механизм юк. Төрле блоклаучылар, дозалар һәм үлчәнгән күрсәткечләр белән өч тәҗрибә бар. Башта шартларны укыгыз. Нәтиҗәләр шулардан килеп чыга.

Монда читләтеп узу нәрсәне аңлата

Электроннар чылбырга I комплекс аша (NADHтан) яки II комплекс аша (сукцинаттан) керә, III комплекс аша цитохром cга, аннары IV комплекс аша кислородка күчә. Бу юлда барлыкка килгән градиентны күзәнәк ATP ясау өчен куллана.

Читләтеп узу турындагы фикер буенча, метилен зәңгәре электроннарны блокка кадәрге өлештән алып, блоктан соңгы өлешкә тапшыра. Оксидлашкан буягыч электроннарны NADHтан яки чылбырның башлангыч компонентларыннан алып, лейкометилен зәңгәренә әйләнә, ә кайтарылган форма аларны цитохром cга яки яңадан чылбырга тапшыра. Электроннар блоктан соңгы өлешкә тапшырылса, сулыш һәм мембрана потенциалы өлешчә торгызыла. Алар блок урынына яки аңа кадәрге өлешкә тапшырылса, берни дә торгызылмый.

Бу бәхәстә күп нәрсәне III комплексның бер үзенчәлеге хәл итә. Комплекс ике ингибитор бәйләнү урыны булган Q циклы буенча эшли. Антимицин Qi урынына бәйләнә. Миксотиазол Qo урынына бәйләнә. Аларның берсен генә кулланган тикшеренү комплексның яртысын гына сынаган була.

Беренче тикшеренү: тычкан миенең митохондрияләрендә читләтеп узу юк

Gureev һәм хезмәттәшләре C57BL/6 тычканнарының баш мие кабыгыннан дигитонин ярдәмендә аерып алынган митохондрияләрне кулланган; үлчәүләр аксым концентрациясе 0.1 mg per ml булганда үткәрелгән. Субстратлар өч режимны колачлаган: һәркайсы 5 mM булган пируват һәм малат, 2 mM глутамат белән 10 mM сукцинат, һәм 10 mM L-пролин. Блоклаучылар итеп 1 micromolar ротенон (I комплекс) һәм 1 microgram per ml антимицин (III комплекс) кулланылган. Буягыч дозалары 0.5, 1 һәм 2 micromolar булган, төп концентрация — 1 micromolar. Ысуллар һәм яздырылган кәкреләр FEBS Letters хәбәрендә бирелгән.

I комплексны читләтеп узу эшләгән. Ротенон ADP белән стимуллаштырылган сулышны якынча 121 дән якынча 2 nmol per minute per mg га кадәр киметкән, ә 1 micromolar буягыч аны якынча 21 гә кадәр торгызган. Мембрана потенциалы пируват һәм малатта да, L-пролинда да торгызылган.

III комплексны читләтеп узу эшләмәгән. Антимицин сулышны якынча 16 га кадәр киметкән, ә буягыч аны нибары якынча 20 гә кадәр күтәргән. Буягыч дозалары 5 micromolar га кадәр булганда да, бер субстратта да мембрана потенциалы торгызылмаган. Пероксид турындагы мәгълүматлар да шул ук юнәлешне күрсәткән: буягыч үзе генә пероксид бүленеп чыгуын якынча 76 pmol per minute per mg булган башлангыч тизлектән өч дозада якынча 1170, 1460 һәм 1945 кә кадәр күтәргән, ләкин антимицин буягыч тудырган бу сигналны, тиешенчә, якынча 25, 88 һәм 96 процентка киметкән. Кайтарылган буягыч кислород белән турыдан-туры реакциягә керсә, III комплексны блоклау сигналны басарга тиеш булмас иде. Авторлар кайтарылган буягыч III комплексның Qo урынында, антимицин блогына кадәр оксидлаша дигән нәтиҗәгә килгән. Кыска әйләнешне сүз белән әйтсәк: донорлардан буягычка, буягычтан Qoга, аннары гадәти юл буенча алга. Ротенон читләтеп үтелә. Антимицин — юк.

Икенче тикшеренү: өч төрдә дә, ике ингибитор урынында да өлешчә читләтеп узу

Svab һәм хезмәттәшләре тәҗрибә схемасын киңәйткән. Тычкан, күсе һәм диңгез дуңгызы миеннән Percoll ярдәмендә аерып алынган митохондрияләр шул ук 0.1 mg per ml концентрациядә, һәркайсы 5 mM булган пируват һәм малатта яки глутамат һәм малатта тикшерелгән. Алар III комплексның ике блоклаучысын кулланган: 0.3 micromolar антимицин A һәм 1 micromolar миксотиазол. Күпчелек үлчәүләрдә буягыч концентрациясе 2 micromolar, цитохром c белән эштә 0.5 булган. Бердәй протоколлар буенча тикшерелгән өч төрнең дә нәтиҗәләре ачык керүле мәкаләдә бирелгән.

Өч төрнең барысында да ике блок та өлешчә читләтеп үтелгән. Тычкан митохондрияләрендә антимицин сулышны баскан, ә буягыч аны якынча 60 процентка, якынча 37 дән 59 nmol per minute per mg га кадәр күтәргән. Миксотиазол аны 88 процентка, якынча 4.5 кә кадәр киметкән, ә буягыч аны биш тапкыр, якынча 23 кә кадәр күтәргән. Ике ингибиторның һәркайсы булганда мембрана потенциалы өлешчә яңадан полярлашкан; оптик артефактларны исключить итү өчен аны ике буягыч (сафранин O һәм ратиометрик TMRM) белән үлчәгәннәр.

Бу мәкаләдә электроннарны тапшыру турыдан-туры да тикшерелгән; беренче тикшеренүдә моны эшләмәгәннәр. Энергияле халәттәге митохондрияләр ингибиторлар белән дә, аларсыз да 25 micromolar тыштан өстәлгән ацетиллаштырылган цитохром cны кайтармаган, ләкин буягыч өстәү ике очракта да кайтарылуны китереп чыгарган. Күзәнәкләрсез буферда NADH һәм буягыч цитохром cны NADHка пропорциональ тизлектә кайтарган. Озынрак сикерешне сүз белән әйтсәк: кайтаручы эквивалентлардан буягычка, буягычтан турыдан-туры цитохром cга, IV комплекс аша кислородка. Бу юл III комплексны тулысынча калдырып уза, шуңа күрә ике блоклаучыны да читләтеп узарга мөмкин.

Ике өстәмә күрсәткеч бу аңлатманы хуплый. Миксотиазол белән эшкәртелгән митохондрияләргә буягыч өстәгәндә NAD(P)H флуоресценциясе кимегән, ягъни кайтаручы эквивалентлар яңа юл аша сарыф ителгән. Буягычның 660 nm дагы яктылык йотуы һәр өстәүгә чиратлап җавап биргән, ә центрифугалаудан соңгы супернатантлар энергияле халәттәге митохондрияләр эчендә оксидлашкан буягычның йөз тапкырдан артык туплануын, аннары потенциал җимерелгәч чыгып китүен күрсәткән. Протоннар исәбе дә моңа туры килә: протоннарны күчерү баскычларын калдырып узганда, һәр электрон пары өчен 10 урынына якынча 2 протон кала. Шуңа күрә кислородның тизрәк кулланылуы белән бары тик өлешчә яңадан полярлашу — чын читләтеп узуның күренеше, аңа каршы дәлил түгел.

Шул ук препаратта өстән-өстән укуны ялгыш нәтиҗәгә китерә торган җаваплар да күзәтелгән. Ингибитор һәм буягыч булганда ADP сулышны күтәрү урынына киметкән, ә транспортны блоклау аны акрынайту урынына стимуллаштырган; шул ук вакытта мембрана потенциалы гадәти юнәлешләрдә үзгәргән. Бу системада кислород кулланылуына гына таяну адаштыра.

Өченче тикшеренү: III түгел, ә I һәм II комплексларны сынаган бавыр тикшеренүе

Lee һәм Boelsterli тычкан бавыры митохондрияләрен һәм эфавиренз (I комплекс, IC50 якынча 30 micromolar) һәм изониазид метаболиты гидразин (II комплекс, IC50 якынча 30 micromolar) белән зарарланган, культурада үстерелгән гепатоцитларны кулланган. Якынча 30 micromolar буягыч NADH оксидлашуын, мембрана потенциалын һәм ATPны торгызган, шул ук вакытта оксидлаучыларны һәм некротик үлемне киметкән. Redox Biology мәкаләсендә бу күренеш буягычның электроннарны зарарланган I һәм II комплексларны читләтеп күчерүе итеп модельләштерелә.

Бу нәтиҗә чылбырның алдагы өлешенә караган расланган контекст булып тора, һәм ул III комплекс турында берни дә әйтми, чөнки анда бу комплекс блокланмаган. Ул ми буенча ике тикшеренүнең берсен дә раслый яки кире кага алмый.

Шартлар матрицасы

III комплекс турындагы ике тикшеренүнең дә үз шартлары өчен дөрес була алуына дүрт сәбәп

1. Блоклаучылар бер үк тәэсир булмаган. Бер якта — 1 microgram per ml антимицин гына, икенче якта — 0.3 micromolar антимицин һәм аерым Qo урыны блоклаучысы. Буягыч электроннарны Qo урынына тапшыра торган юл нәкъ цитохром cга турыдан-туры тапшыру юлы уңышлы булган урында эшләми. Бер урын икесен дә алыштыра алмый.

2. Буягыч дозасы һәм вакыт аерылган. Төп концентрацияләр — 1 һәм 2 micromolar; сүз оксидлашу-кайтарылу циклында катнашучы, үзләштерелүе һәм цитохром cны турыдан-туры кайтаруы концентрациягә һәм вакытка бәйле матдә турында бара. Дозадагы кечкенә аермалар һәм күрсәткечләрне төрле вакытта үлчәү бер үк челтәрнең төрле тармакларын ачып күрсәтә ала.

3. Препаратлар аерылган. Дигитонин белән аерып алу һәм Percoll градиентында аерып алу өлешчә бер-берсенә туры килә торган, ләкин бердәй булмаган митохондриаль популяцияләрне сайлап ала. Аксым концентрациясе икесендә дә 0.1 mg per ml булган, шуңа күрә бу үзгәрүчән төшереп калдырыла, ләкин субпопуляция һәм бөтенлек түгел. Төр аермасына шик тә алып ташланган: икенче төркем шул ук фенотипны тычканда да кабатлаган.

4. Субстрат халәте буягычның нәрсә эшли алуын билгели. Бер якта — өч субстрат режимы, икенче якта — NADH белән бәйле парлар. NADH белән тәэмин ителү һәм мембрана потенциалы бергәләп буягычның ни дәрәҗәдә тиз кайтарылуын һәм кайда бүленеп урнашуын билгели. Оксидлашкан цитохром c янында кайтарылган буягыч таләп итә торган юл бу сайлауга бәйле.

Киләсе читләтеп узу турындагы раслауны ничек укырга

Кайсы комплексның, кайсы ингибитор белән, кайсы урында һәм нинди дозада блокланганын сорагыз. Буягыч концентрациясен һәм күрсәткечнең кайчан үлчәнгәнен сорагыз. Тукыманы, төрне, аерып алу ысулын, аксым концентрациясен һәм субстратны сорагыз. Потенциал, сулыш, оксидлашу-кайтарылу халәте һәм турыдан-туры электрон тапшыру сынавы нәтиҗәләренең үзара туры килүен дә сорагыз, чөнки монда кислород кулланылуы гына берничә тапкыр ялгыш юнәлеш күрсәткән.

Тар кысалардагы йомгак үз көчендә кала. Буягычның I комплексны читләтеп узуы буенча килешү бар. III комплекс очрагында 1 microgram per ml антимицин һәм 1 micromolar буягыч кулланылган тычкан митохондрияләре функциональ читләтеп узу күрсәтми. Ә 0.3 micromolar антимицин яки 1 micromolar миксотиазол һәм 2 micromolar буягыч кулланылган өч төрдә буягычтан цитохром cга турыдан-туры электрон тапшыру белән өлешчә читләтеп узу күзәтелә. Бу җөмләләр бер-берсенә каршы килми. Моннан киңрәк нәтиҗәләрнең барысы да — экстраполяция.

Бәйле уку материаллары бәхәсле раслауны бәхәссез химия кысаларында тота: электроннарны тапшыру эстафетасы өчен — метилен зәңгәре электроннарны ничек күчерә, чылбырның алдагы өлешендәге расланган очрак өчен — I комплексны читләтеп узу тәҗрибәләре, ике буягычның ни өчен кирәк булуын аңлау өчен — мембрана потенциалы күрсәткечләре һәм аларның артефактлары, ә доза һәм вакыт сайлаудагы тозаклар өчен — оксидлашу-кайтарылу циклында катнашучы матдәләр белән лабораториядә эшләү.