Yeni metilen mavisi ve retikülosit boyama: ayrı bir boya ve canlı hücre yöntemi

Bir öğrenci retikülosit sayımı için hazırlık yapar, metilen mavisi sipariş eder, kanla karıştırır ve neredeyse hiçbir şey göremez. Bir sınıf arkadaşı, üzerinde yeni metilen mavisi yazan bir şişe kullanır ve eritrositlerin bir bölümünde belirgin mavi filamentler elde eder. İlk öğrenci, ikinci şişedeki boyanın daha taze veya daha konsantre olduğunu varsayar. İkisi de doğru değildir. Şişe farklı bir molekül içerir.

Bu alandaki karışıklıkların çoğunun temelinde bu kavramsal hata yatar. Adı, yeni metilen mavisinin metilen mavisinin geliştirilmiş bir partisi olduğunu düşündürür. Kimyası ise farklı olduğunu gösterir. Yeni metilen mavisi N, kendine ait Colour Index numarası, sübstitüsyon düzeni ve hematolojide standartlaştırılmış kullanım alanı olan ayrı bir fenotiyazin boyasıdır. Bu ayrım netleştiğinde yöntemin geri kalanı da anlaşılır hale gelir: boyama sırasında hücrelerin neden canlı olması gerektiği, hangi hücrelerin retikülosit sayıldığı, Heinz cisimciklerinin bu yöntemdeki yeri ve parlak krezil mavisinin ne zaman devreye girdiği.

Kısa yanıt

Hematoloji reaktifi olan yeni metilen mavisi N, genellikle yeni metilen mavisine ait PubChem kaydında Basic Blue 24, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, C18H22ClN3S formülüyle tanımlanır. Normal metilen mavisi ise PubChem kaydında metiltiyoninyum klorür, Basic Blue 9, C.I. 52015, CAS 61-73-4, C16H18ClN3S formülüyle tanımlanır. Yapısal olarak yeni metilen mavisi, halkaya bağlı iki metil grubu ve etilamino yan zincirleri taşırken metilen mavisi dimetilamino grupları taşır. Bu fark, boyama davranışını değiştirir. Hematoloji kaynakları, normal metilen mavisini görece zayıf bir retikülosit boyası, yeni metilen mavisini ise daha yoğun ve daha homojen boyama sağlayan bir boya olarak tanımlar. Bu karşılaştırma ScienceDirect'in yeni metilen mavisi konusundaki sayfasında özetlenmiştir.

Evet, yeni metilen mavisi supravital bir boyadır. Supravital boyama, NCBI'nin supravital boyama ilkelerini ele alan derlemesinde tanımlandığı üzere, canlı hücrelerin vücuttan alındıktan sonra ve fiksasyondan önce boyanmasıdır. Hem yeni metilen mavisi hem de parlak krezil mavisi bu kategoriye girer ve CLSI retikülosit standardı, yeni metilen mavisini açıkça supravital boya olarak ele alır. Öğrenciler bazen bu yöntemi, fikse edilmiş yaymaların Romanowsky ile boyanmasıyla aynı kategoride düşünür. Bu yaklaşım burada geçerli değildir. Önce fiksasyon yapılırsa yöntem işlevini kaybeder.

Benzer boya adlarını takip eden okurlar için metil mavisi ile metilen mavisi karşılaştırması, anyonik bir triarilmetan boyası ile katyonik fenotiyazin ailesi arasındaki farklı ve daha kapsamlı bir karışıklığı ele alır. Laboratuvar boyama yöntemlerine genel bakış, supravital çalışmaları fikse yayma yöntemleriyle birlikte ele alır; kan hücresi morfolojisi rehberi ise retikülosit değerlendirmesinin daha kapsamlı lökosit diferansiyel değerlendirmesindeki yerini gösterir.

Kataloglarla ilgili bir uyarı: yeni metilen mavisinin CAS 6586-05-6 numarası altında ayrı bir çinko klorür çift tuz formu da bulunur. Bu nedenle yöntem bölümünde yalnızca yaygın ad değil, tuz formu ve tedarikçi de belirtilmelidir.

Supravital boyama gerçekte ne yapar?

Retikülosit, çekirdeğini kaybetmiş ancak artık ribozomal RNA içeren genç bir eritrosittir. Boyanmamış bir yaş preparatta bu RNA görünmez. Supravital boya canlı hücreye girer ve bu RNA'yı çöktürerek veya kümeleştirerek mavi granüllere ve filamentlere dönüştürür. Bunlar, immersiyon yağı altında görülen retikülofilamentöz materyaldir. Dolayısıyla ağ yapısı, renklenmeyi bekleyen önceden oluşmuş bir iskelet değil, boyama sonucunda oluşan bir üründür. Protokol değişkenlerinin (boya konsantrasyonu, tampon, kan/boya oranı, sıcaklık, süre) boya adı kadar önemli olmasının nedeni budur.

Pratikte bunun sonucu, işlemlerin kesin bir sırayla yapılmasıdır: önce antikoagülanlı kanı boyayla karıştırın, inkübe edin, ardından yaymaları hazırlayın ve fiksasyon ya da karşıt boyama uygulamadan inceleyin. Boyamadan önce fiksasyon yapılması veya silik filamentleri örten bir karşıt boyama uygulanması, sayımın dayandığı bilgiyi ortadan kaldırır.

Yeni metilen mavisi ile uygulanabilir bir retikülosit protokolü

Tek bir evrensel formülasyon yoktur; bu nedenle kullanılan formülasyonu bildirin. Belgelenmiş üç varyant, uygulamalar arasındaki çeşitliliği gösterir.

Klasik Brecher tipi prosedürde potasyum oksalat içeren yaklaşık yüzde 0.5 yeni metilen mavisi, iyice karıştırılmış EDTA'lı kanla eşit hacimlerde karıştırılır ve oda sıcaklığında yaklaşık 10 ila 15 dakika inkübe edilir. Nazikçe yeniden karıştırıldıktan sonra ince kama yaymalar hazırlanır, havada kurutulur ve fikse edilmeden 100x yağ immersiyon objektifiyle incelenir. NCBI'nin retikülosit sayım prosedürü, bu iş akışını ve onunla birlikte kullanılan sayım çerçevesini açıklar.

Dacie ve Lewis varyantında, sitratlı salin içinde yüzde 1.0 yeni metilen mavisi kullanılır; 2 ila 4 hacim kanla karıştırılır ve yayma hazırlanmadan önce 37 C'de 15 ila 20 dakika bekletilir. CLSI H44 prosedürüne yönelik yakın tarihli bir harmonizasyon uygulamasında, 2026 NMB harmonizasyon çalışmasında bildirildiği üzere, pH 7.4 fosfat tamponlu salin içinde daha düşük konsantrasyonlu, yüzde 0.1'lik bir çözelti kullanılmış, 20 C'de 10 dakika inkübasyon uygulanmış ve fiksasyon yapılmamıştır.

Sayım kuralları tüm varyantlarda ortaktır. Bir hücreyi, en az iki ayrı mavi boyanan granül veya filament parçası içeriyorsa retikülosit olarak sayın; böylece tek başına bulunan boya birikintileri dışlanır. Rutin çalışmalarda en az 1,000 eritrosit sayın ve retikülositleri yüzde olarak bildirin. Düşük yüzdelerde istatistiksel gereklilikler daha fazla hücre sayılmasını gerektirir. CLSI H44 metodolojisini ele alan bir derleme, retikülosit oranı yüzde 1 civarındayken sayım varyasyonunu yüzde 5'e indirmek için yaklaşık 4,400 hücrenin gerektiğini belirtir; bu bilgi De Gruyter'deki CLSI H44 derlemesinde yer alır. Miller oküler diski, yüksek sayıda hücrenin sayılmasını pratik hale getirir. Boyayı filtreleyin veya taze hazırlayın; çünkü çökelti, granüler inklüzyonları taklit eder.

Aynı preparatta Heinz cisimcikleri

Aynı supravital yaymada, artık RNA yerine oksitlenmiş ve denatüre hemoglobin kümelerinden oluşan Heinz cisimcikleri de gösterilebilir. Yeni metilen mavisi preparatlarında bunlar, genellikle tek başına ve membrana yakın bulunan, retikülofilamentöz materyalden daha açık mavi boyanan yuvarlak cisimcikler olarak görünür. Fiksasyon ve karşıt boyama sırasında iyi korunmazlar; bu nedenle fikse edilmemiş yaymayı inceleyin. 20 mikrolitre EDTA'lı kan ile 20 mikrolitre yüzde 1 yeni metilen mavisi ve 15 dakikalık inkübasyon kullanan yakın tarihli bir protokolde, 250 eritrosit arasında Heinz cisimciği pozitif hücreler sayılmıştır. Bu prosedür PMC'de yayımlanan çalışmada bildirilmiştir.

İki ayrım, yanlış yorumları önler. Birincisi, ScienceDirect'in Heinz cisimciği konusundaki sayfasında belirtildiği üzere, metil viyole ve kristal viyole Heinz cisimciklerini yeni metilen mavisinden daha yoğun boyar. Yeni metilen mavisi, retikülositler ve Heinz cisimcikleri birlikte değerlendirildiğinde kullanışlı bir seçenektir; yalnızca Heinz cisimciklerini boyamak için en güçlü boya değildir. İkincisi, alfa talasemi taşıyıcılığındaki HbH inklüzyonları supravital boyamadan sonra hücrenin tamamında çok sayıda ince nokta oluştururken klasik Heinz cisimcikleri daha az sayıda, daha büyük ve sıklıkla membranla ilişkili olur. Üçüncü benzer görünüm boya birikintisidir: hücrelerin odak düzleminin dışında bulunur ve görüş alanları arasında değişiklik gösterir.

Parlak krezil mavisi ile yeni metilen mavisinin karşılaştırılması

Her iki boya da retikülositler için supravital boyadır; ancak standardizasyon bunlardan birini tercih eder. International Council for Standardization in Haematology ile ortak geliştirilen ve CLSI H44 standardı sayfasında listelenen CLSI H44-A2 retikülosit yöntemi, EDTA'lı kanın yeni metilen mavisiyle boyanmasını manuel karşılaştırma yöntemi olarak belirler. Klasik hematoloji öğretisinde de görünüm açısından aynı görüş benimsenir: yeni metilen mavisi filamentleri daha yoğun ve daha homojen boyarken parlak krezil mavisinin boyama özellikleri partiler ve örnekler arasında daha fazla değişkenlik gösterir.

Bu statünün bir sınırlaması vardır. ICSH analizör değerlendirme kılavuzu, manuel yeni metilen mavisi mikroskopisini referans karşılaştırma yaklaşımı olarak kabul eder; ancak öznel ve görece düşük kesinliğe sahip olduğunu belirtir ve mevcut olduğunda akım sitometrisine dayalı referans prosedürlerini tercih eder. 100 örneğin değerlendirildiği 2022 tarihli bir karşılaştırmada, kullanılan analizöre göre parlak krezil mavisinin yeni metilen mavisinden daha düşük yanlılık gösterdiği bulunmuştur. Bu sonuç PMC'deki boyama yöntemleri karşılaştırmasında bildirilmiştir. Öğrenciler için savunulabilir özet şudur: yeni metilen mavisini standartlaştırılmış manuel karşılaştırma boyası olarak kullanın, yerel olarak kullanılan herhangi bir parlak krezil mavisi yöntemini bu yöntemle veya otomatik ölçümle karşılaştırarak doğrulayın ve her iki durumda da manuel mikroskopide daha geniş bir sonuç dağılımı bekleyin. Daha eski standardizasyon literatürü, ticari boya partileri arasındaki değişkenlik nedeniyle, kimyasal açıdan daha saf bir alternatif olarak saflaştırılmış Azure B kullanımını da savunmuştur. Bu yaklaşım Marshall'ın Azure B çalışmasında yer alır ve reaktif saflık derecesinin yöntem tartışmalarında neden hâlâ gündeme geldiğini açıklar.

Yaygın hatalardan kaçınma

Başarısız preparatların çoğu dört hatadan kaynaklanır. Yeni metilen mavisi N yerine normal metilen mavisi sipariş etmek, teknikten değil kimyadan kaynaklanan zayıf boyamaya yol açar. İncelemeden önce fiksasyon veya karşıt boyama uygulamak supravital sinyali ortadan kaldırır. Boya çökeltisini granül olarak saymak sonucu olduğundan yüksek gösterir; iki granül kuralı ve filtrelenmiş boya bunu önler. Düşük retikülosit yüzdelerinde çok az hücre saymak, kesin görünen ancak güven sınırları geniş olan bir sayı üretir. Her hatada aynı durum ortaya çıkar: mikroskopist, reaktif aşamasında belirlenen sonuç için mikroskobu suçlar.