Yanak hücrelerini metilen mavisiyle boyama: neler gözlemlenmeli

Bir öğrenci, lamın üzerine bir damla yanak hücresi süspansiyonu koyar, mikroskoptan bakar ve neredeyse hiçbir şey göremez. Aydınlık bir görüş alanında birkaç soluk siluet süzülür. Önce odağı ayarlar, sonra ışığı artırır ve sonunda lamın boş olduğu sonucuna varır. Lam boş değildir. Hücreler oradadır. Neredeyse saydamdırlar ve bu boyanın çözmek için kullanıldığı sorun tam da bu saydamlıktır.

Protokole başlamadan önce beklenti ile görüntü arasındaki bu uyuşmazlığı açıklamak gerekir. Yeni başlayanlar, bir mikroskobun ayrıntıları, kamerayla yakınlaştırmanın uzaktaki bir tabelayı görünür kılması gibi ortaya çıkarmasını bekler. Aydınlık alan mikroskobu daha sınırlı bir şey yapar: ışığın soğurulmasındaki farklılıkları gösterir. Boyanmamış bir yanak hücresi neredeyse hiç ışık soğurmaz, dolayısıyla görüntüde neredeyse hiç fark oluşturmaz. Metilen mavisi bu farkı sağlar. Hücrenin içinde farklı bölgelere eşit olmayan miktarlarda bağlanır ve yapıyı kontrasta dönüştürür. Öğrenciler bu kavramı anladığında, sonraki her adım bir tarifin parçası olarak değil, bu kavramın bir sonucu olarak anlam kazanır.

Basit boyamaların okul laboratuvarında nasıl kontrast sağladığına ilişkin temel bilgiler burada yardımcı olur; boyamadan önce aydınlık alan mikroskobunu hazırlama konusunu gözden geçirmek de başarısız preparatların yarısını önler. Rengin arkasındaki kimya, bu boyanın neden laboratuvar tezgâhında sürekli karşımıza çıktığını ele alan mikroskopide metilen mavisine giriş yazısında açıklanır.

Sınıf protokolü

Aşağıdaki yaş preparat yöntemi, genel sınıf uygulamaları için daha basit bir başlangıç seçeneğidir. Alev veya fiksasyon adımı gerektirmez. Bazı üniversite kılavuzlarında kullanılan fikse edilmiş yayma yönteminde, Biology LibreTexts üzerinden yayımlanan North Central Texas College yanak yayması etkinliğinde olduğu gibi havada kurutma ve kısa süreli ısıyla fiksasyon eklenir. Ancak ısıyla fiksasyon, epitel hücrelerini görmek için bir gereklilik değil, mikrobiyolojide yerleşik bir uygulamadır.

Gerekenler: temiz lamlar ve lameller, steril tek kullanımlık sürüntü çubukları (tercih edilir) veya yeni yassı kürdanlar, damlalıklı şişede yüzde 0.5 ila 1'lik sulu metilen mavisi çözeltisi, damıtılmış veya deiyonize su, kurutma kâğıdı, eldivenler ve 100x ve 400x toplam büyütme sağlayan bileşik mikroskop.

1. Ağzı yalnızca suyla çalkalayın. Bu işlem, daha sonra yoğun biçimde boyanarak hücrelerden dikkati uzaklaştıran yiyecek parçacıklarını giderir.
2. Her öğrenci yalnızca kendi yanağından numune alır. Yanağın iç yüzeyini yeni ve steril bir sürüntü çubuğuyla hafifçe ovun. Bastırın, kazımayın. Herhangi bir rahatsızlık veya kanama oluşmasına fırsat vermeden durun.
3. Sürüntü çubuğunu temiz bir lamın ortasında yuvarlayarak ince bir tabaka oluşturun. İnce bir tabaka, preparatın net biçimde incelenebilmesini belirleyen en önemli etkendir. Kalın beyaz bir birikinti, boyandığında ayırt edilemeyen mavi bir kütleye dönüşür.
4. Yaymanın üzerine bir damla metilen mavisi ekleyin. 1 ila 3 dakika bekletin. Birçok üniversite protokolünde bir dakika yeterlidir; NCERT 9. sınıf fen laboratuvarı kılavuzu geçici bir preparat için yaklaşık 3 dakika kullanır. Daha uzun süre daha iyi sonuç vermez; aşırı boyama, süreyle ilgili en yaygın hatadır.
5. Yerel protokole göre damıtılmış suyla hafifçe durulayın veya fazla boyayı kurutma kâğıdıyla emdirerek uzaklaştırın. Arka plan koyu lacivert değil, soluk mavi olmalıdır.
6. Lameli, önce bir kenarı temas edecek şekilde eğik olarak indirin, ardından yavaşça bırakın. Bu, hava kabarcıklarının oluşmasını önler.
7. Hücreleri bulmak için düşük büyütmeyle başlayın, odağı ve merkezlemeyi kontrol edin, ardından 100x ve son olarak 400x büyütmeye geçin. 400x büyütmede yalnızca ince ayar vidasını kullanın.

Boya konsantrasyonu hakkında bir noktayı netleştirmek gerekir. Okul protokollerinde genellikle yüzde 1'lik sulu metilen mavisi kullanılır. Daha yüksek konsantrasyonlu stok çözelti veya uzun maruz kalma süresi, arka planı çekirdekten daha hızlı koyulaştırır ve böylece uygulamanın dayandığı kontrast ilişkisini tersine çevirir.

Yanak numunelerini güvenli biçimde kullanma

Yanak numuneleri tükürük ve normal ağız mikroorganizmaları içerir. Bu nedenle numuneyi verenler sağlıklı sınıf arkadaşları olsa da her taze yaymayı potansiyel olarak enfeksiyöz materyal kabul edin. American Society for Microbiology'nin eğitim laboratuvarları için biyogüvenlik yönergeleri genel ilkeleri belirtir: uygulamadan önce riski değerlendirin, eldiven takın, sıçrama olasılığı varsa gözleri koruyun, işlemden sonra elleri yıkayın, tezgâhları dezenfekte edin ve kontamine tek kullanımlık malzemeleri onaylı biyolojik atık prosedürüne göre atın.

Sınıfta uygulanacak dört kural, risklerin çoğunu kontrol altına alır. Her sürüntü çubuğu ve her lam yalnızca bir kişiye ait olmalı, asla paylaşılmamalıdır. Öğrenciler yalnızca kendilerinden numune almalı, yanlarındaki kişiden numune almamalıdır. Tek kullanımlık sürüntü çubukları ve kürdanlar doğrudan belirlenmiş atık kabına atılmalı, tekrar tezgâha konulmamalıdır. Metilen mavisi cildi ve giysileri boyar, gözleri tahriş eder; bu nedenle eldiven kullanımı ve boyalarla çalışırken uygulanan standart hijyen kuralları geçerlidir. Bu uygulamayı yaymadaki herhangi bir materyalin kültürünü üretmeye kadar genişletmeyin ve okulun güvenlik prosedürü dışında taze insan materyaline kendi yöntemlerinizle ısıyla fiksasyon uygulamayın.

Neler gözlemlenmeli ve neden böyle görünürler

100x büyütmede, düzensiz oval veya çokgen sınırlara sahip, soluk mavi, geniş ve yassı hücreleri arayın. Tek tek veya gevşek biçimde üst üste binmiş tabakalar hâlinde bulunurlar. Her hücrede genellikle daha koyu mavi bir nokta vardır. Bu nokta çekirdektir. Dizilimlerini de not edin: yassı epitel hücreleri küre değil, ince döşeme taşları gibidir. Bu nedenle kenarları yuvarlak balonlardan çok çatlamış bir sır tabakasını andırır.

400x büyütmede üç özellik açıkça ayırt edilir. Hücre sınırı, hücreyi çevreleyen ince ve daha koyu bir çizgi olarak görünür. Sitoplazma, iç kısmı açık ve eşit dağılmış bir mavi renkle doldurur. Çekirdek daha koyu ve daha yoğun görünür; çoğunlukla ovaldir, genellikle merkeze yakındır ancak her zaman değil. Öğrencilerden bu üç özelliğin yanı sıra hücrenin şeklini ve büyütmeyi de kaydetmelerini isteyin; çünkü çalışma kâğıdı tam olarak bunları sorar.

Burada doğruluk açısından önemli bir nokta vardır ve birçok çalışma kâğıdı bunu yanlış aktarır. Görünür sınır, plazma zarının bulunduğu bölgeye karşılık gelir. Ancak yaklaşık 7 ila 10 nanometre kalınlığındaki çift katmanlı bir lipit yapısı olan zarın kendisi, okul mikroskobunun ayırt edebileceği boyutun çok altındadır. Öğrencilerin gördüğü şey, hücrenin optik kenarı ve orada biriken boyadır. Aynı dikkat organeller için de geçerlidir. Mitokondriler, endoplazmik retikulum, Golgi cisimcikleri ve ribozomlar bu preparatta görünmez. NCBI'nin mikroskopi araçlarına ilişkin hücre biyolojisi açıklamasında belirtildiği gibi, geleneksel bir ışık mikroskobu iyi koşullarda yaklaşık 0.2 mikrometreye kadar olan ayrıntıları ayırt edebilir; ince yapıların çoğu bu sınırın altında veya yakınındadır. Daha yüksek boş büyütme, ayrıntı eklemeden görüntüyü büyütür.

Çekirdek neden en koyu boyanır? Metilen mavisi, çözeltide pozitif yüklü olan katyonik bir boyadır ve hücredeki negatif yüklü materyalle, özellikle nükleik asitlerle etkileşime girer. Kromatin, DNA'yı çekirdekte yoğunlaştırır; dolayısıyla en çok boya çekirdekte birikir. Sitoplazma RNA ve başka yüklü moleküller içerdiğinden o da boyanır, ancak boyanma daha yaygın ve daha hafiftir. Temel sınırlama şudur: metilen mavisi DNA'ya özgü bir boya değildir. Çekirdek görüntülemede metilen mavisinin dağılımına ilişkin çalışma, katyonun nükleik asit bakımından zengin bölgelerle etkileşimini açıklar. Hücre preparatlarında metilen mavisinin bağlanmasına ilişkin daha eski nicel çalışma ise bağlı boyanın çoğunun nükleik asitlerle ilişkili olduğunu bulmuştur. Bu nedenle koyu çekirdek ve açık sitoplazma görünümü, moleküler bir analiz değil, bir kontrast örüntüsüdür.

Öğrencilerin yapacağı hatalar ve bunları yorumlama

Başarısız preparatların neredeyse tamamı beş örüntüden birine uyar. Öğrencilere işlemi düşünmeden tekrarlamak yerine preparattaki sorunu belirlemeyi öğretin.

Aşırı boyama, hücreleri ve arka planı eşit biçimde koyulaştırır; çekirdek görüş alanında seçilemez hâle gelir. Boyama süresini kısaltarak veya daha kapsamlı durulayarak düzeltin. Yetersiz boyama, ışık artırıldığında kaybolan soluk siluetler bırakır; süreyi otuz saniyelik aralıklarla uzatın. Kalın yaymalar, hiçbir hücre sınırının izlenemediği, yoğun ve üst üste binmiş kütleler oluşturur. Düzeltme mekaniktir: bir sonraki sefer daha ince yayın, çünkü hiçbir durulama üst üste yığılmış hücreleri kurtaramaz. Hava kabarcıkları, keskin ve koyu kenarlı kusursuz daireler olarak görünür ve bunları hücresel yapılar sanan yeni başlayanların dikkatini dağıtır; lameli eğik biçimde, yavaşça yeniden yerleştirin. Ingrid Science yanak hücresi prosedürü gibi okul protokollerinde belirtildiği üzere, hücrelerin üzerinde veya çevresinde dağılmış küçük koyu noktalar genellikle normal ağız bakterileridir. Ağızda mikroorganizmaların yaşadığını gösterirler; bu, öğrencilerin aklında kalabilir. Ancak bu uygulamada tür düzeyinde tanımlanamazlar ve hücrenin parçaları olarak çizilmemelidirler. Yiyecek kalıntıları ve mukus iplikleri düzensiz ve yoğun biçimde boyanır; ön çalkalama bunları azaltmak içindir.

Bu uygulamanın yapamayacakları

Bu, eğitim amaçlı bir gözlemdir, tanı testi değildir. Sınıfta yapılan bir boyamada hücrelerin görünümüne bakılarak enfeksiyon, kanser veya herhangi bir hastalık tanısı konulamaz; bu yazı da bunun mümkün olduğunu ima ediyor şeklinde okunmamalıdır. Preparat, iki büyütmede hücrenin şeklini, sınırını, sitoplazmasını ve çekirdeğini gösterir. Zarın ince yapısını, organel ayrıntılarını veya moleküler kimliği göstermez. Sınırları açıkça belirtmek hem bilimi hem öğrencileri korur: iyi bir sonuç, sağlık hakkında bir çıkarım değil, büyütmenin ve kullanılan boyanın kaydedildiği, doğru etiketlenmiş bir çizimdir.

Öğrenci çalışma kâğıdı ve etiketli mikrograflar

Bu sayfa için hazırlanan iki materyal, yukarıdaki etiketli mikrograf ve aşağıdaki çalışma kâğıdıdır. Çalışma kâğıdını her öğrenci için bir tane yazdırın veya ekrana yansıtıp öğrencilerden kutuları defterlerine kopyalamalarını isteyin.

45 dakikalık bir derste kullanımı: güvenlik bilgilendirmesi ve numune alma için on dakika, boyama ve preparat hazırlama için on dakika, her iki büyütmede gözlem ve çizim için on beş dakika, kontrol listesi ve etiketli mikrografla karşılaştırma için on dakika. Kontrol listesindeki maddeler özellikle somut işlem ve gözlem ölçütlerine dayanır. İnce yayma, doğru boyama süresi, sitoplazmadan daha koyu çekirdek, kaydedilmiş büyütme. Dördünü de işaretleyebilen bir öğrenci, dersin öğretmeyi amaçladığı kavramı anlamıştır: mikroskoplar farklılıkları gösterir, boyalar ise gösterilmeye değer farklılıklar oluşturur.