Metilen mavisiyle basit boyama ve Gram boyama: her yöntem neyi kanıtlayabilir

Bir öğrenci, E. coli olarak etiketlenmiş bir kültürden yayma preparatı hazırlar, üzerini bir dakika boyunca metilen mavisiyle kaplar, durular ve yağ immersiyon objektifiyle inceler. Görüş alanını mavi çomaklar kaplar. Laboratuvar raporunda şu ifade yer alır: "E. coli olarak tanımlanan Gram-negatif çomaklar." Gözlem doğrudur. Ancak bu preparat, varılan sonucu desteklemez.

Hata teknik değil, kavramsaldır. Öğrenci, basit boyamayı ayırt edici bir testmiş gibi değerlendirmiştir. Basit boyama ve Gram boyama, farklı boyama ilkelerine dayandıkları için farklı soruları yanıtlar. Biri şu soruyu sorar: hangi şekil mevcut? Diğeri ise şunu sorar: hücre duvarı bir işleme maruz bırakıldığında nasıl davranır? Bu ikisi karıştırıldığında, doğru boyanmış bir preparat bile dayanağı olmayan bir rapora yol açar.

Bu karşılaştırma, iki yöntemi ayrı ele alır, her sonucun hangi ifadeleri desteklediğini gösterir ve öğrencilerin en sık sorduğu iki soruyu yanıtlar: metilen mavisi Gram boyamada kullanılabilir mi ve E. coli'nin metilen mavisiyle boyanması gerçekte neyi gösterir?

Kısa yanıt

Metilen mavisiyle basit boyama, boyanabilen tüm hücreleri aynı mavi renge boyar. Bu nedenle morfolojiyi (çomaklar, küreler, spiraller) ve dizilişi (tekler, çiftler, zincirler) gösterir; Gram kategorisi hakkında bilgi vermez. Gram boyama ise iyot, bir renk giderme adımı ve bir karşıt boya ekler. Böylece bakterileri, hücre zarflarının boyayı nasıl tuttuğuna göre Gram-pozitif (mor) ve Gram-negatif (pembe veya kırmızı) olarak ayırır. Metilen mavisiyle boyama sonrasında görülen mavi çomaklar, "çomak şeklinde hücreler mevcut" anlamına gelir. Gram boyama dizisinin tamamı uygulandıktan sonra görülen pembe çomaklar ise "Gram-negatif çomaklar mevcut" anlamına gelir. İkinci ifade daha güçlüdür, çünkü işlem ek bir test içermiştir.

Bu makalenin ele aldığı tek boyalı bakteri yöntemlerinin daha geniş kapsamı için mikroskopi boyama atlasına bakın.

Basit boyama: tek boya, tek soru

Metilen mavisi bazik (katyonik) bir boyadır. Renkli iyonu pozitif yük taşır ve nükleik asitler ile asidik yüzey grupları dahil olmak üzere hücredeki negatif yüklü yapılara bağlanır. Böylece hücreler açık renkli bir arka plan üzerinde mavi görünür. OpenStax, boyama bölümünde bu pozitif boyama ilkesini açıklar. Boya katyonunun kendisi, metilen mavisinin kimyasına ilişkin başvuru kaynağında ayrıntılı olarak açıklanan küçük, düz fenotiyazin iyonudur; rengi veren klorür karşı iyonu değildir.

Standart bir öğretim protokolü bilinçli olarak basit tutulur: ince bir yayma preparatı hazırlayın, havada kurutun, ısıyla tespit edin, üzerini yaklaşık bir dakika boyunca yaklaşık 1% sulu metilen mavisi çözeltisiyle kaplayın, suyla nazikçe durulayın, emici kâğıtla kurulayın ve yağ immersiyonuyla inceleyin. Bir LibreTexts öğretim protokolü, tam olarak bu 1% ve bir dakikalık uygulamayı verir; bazı laboratuvarların süreyi uzattığını da belirtir. Mordan yoktur, renk giderici yoktur, ikinci bir boya yoktur. Yöntemin temel özelliği bu yokluktur. Yalnızca tek boya kullanıldığında ve boya seçici olarak uzaklaştırılmadığında, boyayı bağlayan her hücre aynı renge dönüşür.

E. coli için beklenen görüntü, tek tek, çiftler halinde veya küçük gruplar halinde bulunan mavi çomaklardır (basiller). Mavi renk boyadan gelir. Çomak şekli ise organizmadan gelir. Ancak bu ikisinin birlikte görülmesi organizmayı tanımlamaz; çünkü birçok tür çomak şeklindedir ve birçok çomak, basit boyamada maviye boyanır. ATCC, mikrobiyoloji kültür kılavuzunda yöntemin yalnızca morfolojiyle sınırlı olduğunu açıkça belirtir. Doğru bir rapor şöyle der: "Mavi basiller gözlendi." Şekil ve dizilişin ötesindeki her ifade daha fazla kanıt gerektirir.

Gram boyama: dört reaktif, tek davranış testi

Gram boyama ayırt edici bir boyama yöntemidir. Tüm hücreleri aynı işlem dizisine tabi tutar ve hangi hücrelerin ilk boyayı tuttuğunu, hangilerinin kaybettiğini gösterir. Amerikan Mikrobiyoloji Derneğinin Gram boyama protokolleri, standart dört adımlı sırayı tanımlar: kristal viyole (birincil boya), Gram iyodu (mordan), alkol veya aseton-alkol (renk giderici), ardından safranin (karşıt boya).

Standart öğretim modeli, bu ayrımı hücre zarfının yapısıyla açıklar. Gram-pozitif hücrelerde, alkolle yıkama sırasında su kaybeden ve kristal viyole-iyot kompleksini tutan kalın bir peptidoglikan duvar bulunur. Gram-negatif hücrelerde ise ince bir peptidoglikan tabakası ve renk gidericinin bozduğu, lipit bakımından zengin bir dış zar bulunur. Bu nedenle kompleks yıkanarak uzaklaşır ve hücreler daha sonra safranini alır. NCBI Bookshelf'teki Gram boyama derlemesi, hücre duvarına dayanan bu açıklamayı sunar. Uzmanlar, sürecin tüm fizikokimyasının yalnızca duvar kalınlığından daha karmaşık olduğunu belirtir. Ancak laboratuvarda sonuçları yorumlarken davranışa dayalı kural geçerlidir: mor, boyanın tutulduğu; pembe ise boyanın kaybedilip ardından karşıt boyanın alındığı anlamına gelir.

Temsili paneller. Yöntem karşılaştırması için hazırlanmış stilize çizimlerdir, kamerayla çekilmiş mikrograflar değildir. Mantığı öğretmek için renkler sadeleştirilmiştir: basit boyamada tek renk, Gram boyamanın renk giderme adımından sonra iki renk.

Metilen mavisi Gram boyamada kullanılabilir mi

Bu soru iki şekilde anlaşılabilir ve her biri farklı bir yanıt gerektirir.

Birinci anlam: metilen mavisinin tek sefer uygulanması, tüm Gram boyama dizisinin yerini alabilir mi? Hayır. İyot, renk giderici ve karşıt boya olmadan ayırt edici bir adım bulunmaz; dolayısıyla hiçbir Gram kategorisi test edilmez. Yalnızca metilen mavisi uygulandıktan sonra oluşan mavi bir alan, şişe Gram reaktiflerinin yanında dursa bile basit boyama sonucudur. Bunu Gram boyama sonucu olarak kaydetmeyin.

İkinci anlam: metilen mavisi, 4. adımda karşıt boya olarak safraninin yerini alabilir mi? İşlevsel olarak rengi giderilmiş hücreleri boyayabilir ve bir ders kitabı alıştırması, böyle bir değişiklikten sonra Gram-pozitif hücrelerin mor, Gram-negatif hücrelerin ise mavi olacağını öngörür. Bu mantık doğrudur; çünkü rengi doğru şekilde giderilmiş Gram-negatif hücreler neredeyse renksizdir ve başka bir katyonik boyayı alır. Ancak bu, standart protokol değildir. ASM protokolleri safranini belirtir; bazı varyantlarda bazik fuksin gibi kabul görmüş alternatifler bulunur, ancak metilen mavisi bunlar arasında değildir. Bunun uygulamada bir dezavantajı da vardır: özellikle yeni başlayanlar için ve özellikle ışık gücü azalmış mikroskop lambaları altında, maviyi mordan ayırt etmek pembeyi mordan ayırt etmekten daha zordur. Ders çalışmaları ve önem taşıyan her sonuç için protokolünüzde belirtilen karşıt boyayı, genellikle safranini kullanın. Metilen mavisiyle karşıt boyamayı, standart yöntemle eşdeğer kabul etmek yerine gösterim amaçlı bir varyant olarak değerlendirin.

Metilen mavisinin diğer tek boyalı seçeneklerle nasıl karşılaştırıldığına ilişkin bağlantılı soru, basit bakteri boyamalarının karşılaştırılmasında ele alınır.

E. coli'nin metilen mavisiyle boyanması neyi kanıtlar, neyi kanıtlamaz

E. coli Gram-negatif bir çomaktır. Ancak bu cümle, birkaç yöntemden elde edilen bilgileri birleştirir: morfoloji mikroskopiden, Gram reaksiyonu Gram boyamadan, kimlik ise kültür ile biyokimyasal veya moleküler testlerden gelir. Metilen mavisiyle boyanmış bir yayma preparatı yalnızca ilk kısmı sağlar. Boyanmış örnekte çomak şeklinde hücrelerin bulunduğunu ve bunların nasıl dizildiğini ortaya koyar. Herhangi bir renk giderme işlemiyle sınama yapılmadığı için Gram reaksiyonunu ortaya koymaz. Birçok türün çomakları bu çözünürlükte birbirine benzediği için türü de tanımlamaz.

Raporlar burada öngörülebilir bir şekilde hatalı hale gelir. Raporu yazan kişi, önceden bildiği bilgiyi ("bu kültürün E. coli olması bekleniyor ve E. coli Gram-negatiftir") gözlem satırına aktarır. Böylece preparat, aslında varsayılmış olan bilgiyi doğruluyormuş gibi görünür. Daha açık bir rapor, bilgi katmanlarını birbirinden ayırır: "Metilen mavisiyle basit boyama: mavi basiller gözlendi; yalnızca morfoloji değerlendirildi, Gram kategorisi test edilmedi." Ardından, kontrollerle birlikte doğru bir Gram boyama yapıldıysa: "Gram boyama: pembe çomaklar, Gram-negatif sonuçla uyumlu." Tür kimliği daha sonra, yalnızca renkten değil, tanımlama iş akışından elde edilir.

Uygulamalı bir yorumlama kılavuzu

Laboratuvarda bu karar kuralını kullanın. Tüm hücreler tek renkteyse ve protokolde renk giderici olmadan tek boya kullanıldıysa, basit boyama yaptınız. Şekli, tahmini boyutu ve dizilişi raporlayın. Bunun ötesine geçmeyin. Protokolde, bilinen pozitif ve negatif kontrollerle birlikte kristal viyole, iyot, renk giderici ve karşıt boya uygulandıysa, Gram boyama yaptınız. Rengi morfolojiyle birlikte raporlayın: zincirler halinde mor koklar, pembe çomaklar ve benzeri.

Karışıklıkların çoğu üç hatadan kaynaklanır. Birincisi, mavi çomakları E. coli'nin doğrulanması olarak yorumlamak. İkincisi, metilen mavisiyle boyanmış bir preparatı defterde "Gram boyama" başlığı altında kaydetmek; bu, sonraki okuyucuların sonucu yanlış yorumlamasına yol açar. Üçüncüsü, karşıt boyaları gelişigüzel değiştirip sonra renkler aynıymış gibi farklı laboratuvarların sonuçlarını karşılaştırmak. Her hatanın çözümü aynıdır: gerçekten uygulanan yöntemi adlandırın ve yalnızca o yöntemin test ettiği şeyi ifade edin.

Basit boyama, sınırlı bilgi verdiği için değerlidir. Hızlıdır, küçük uygulama hatalarına toleranslıdır ve soru morfolojiyle ilgili olduğunda yeterlidir: örnekte bir şey var mı ve şekli nedir? Soru sınıflandırmayla ilgili olduğunda ayırt edici testi uygulayın. Mavi preparat, hücrelerin nasıl göründüğünü gösterir. Mor veya pembe preparat, duvarlarının nasıl davrandığını gösterir. Hiçbiri tek başına türü belirlemez.