Metilen mavisinin mitokondriyal etkilerini ölçmek: oksijen, ATP ve membran potansiyeli

Bir laboratuvarın, solunumu bozulmuş mitokondrilere metilen mavisi eklediğini ve oksijen tüketiminin arttığını gözlemlediğini varsayalım. Yazılması doğal görünen cümle, boyanın mitokondriyal işlevi geri kazandırdığıdır. Bu cümle yanlış olabilir. Oksijen akışı, ATP sentezi ve membran potansiyeli üç ayrı kavramdır. Yedekleme, eşitleme ve paylaşımın aynı bulut klasörünü kullanması gibi, bunlar da aynı organelde gerçekleşir: ilişkilidirler, ancak farklı kurallara tabidirler. Birini diğeriyle karıştırırsanız, tüm ölçümler teknik olarak doğru olsa bile yorum hatalı olur.

Metilen mavisi, ölçtüğü sisteme katıldığı için bu karışıklığı olası kılar. Elektronları yolun önceki basamaklarında kabul edip sonraki basamaklarında veren bir redoks döngüleyicisidir; enerji kazanmış mitokondrilerde biriken lipofilik bir katyondur ve yaygın problarla aynı bantlarda ışık soğuran ve yayan, yoğun mavi renkli bir bileşiktir. Tek bir ölçüm bu yükü taşıyamaz. Budapeşte'de yapılan mitokondri çalışmalarında ortaya konan güvenilir yaklaşım; oksijen akışını, ATP sentez hızını, membran potansiyelini ve hidrojen peroksit salımını, her adımda boyaya özgü kontrollerle birlikte ölçmektir.

Respirometri enerji üretimini değil, oksijen akışını ölçer

İster Oroboros Oxygraph ister Seahorse hücre dışı akış analizörü kullanılsın, yüksek çözünürlüklü respirometri tek bir şeyi bildirir: oksijenin ne hızla indirgendiğini. Elektron başına kaç proton pompalandığını, gradyanın ne ölçüde korunduğunu veya ATP sentazın bu gradyanı kullanıp kullanmadığını bildirmez.

Terminoloji önemlidir. İzole mitokondrilerde ADP olmadan substrat verilmesi kaçak solunumu, doyurucu ADP ile substrat verilmesi oksidatif fosforilasyon kapasitesini, ayırıcı titrasyonu ise maksimum elektron aktarım kapasitesini gösterir. Bütünlüğü korunmuş hücrelerde Seahorse karşılıkları; bazal solunum, oligomisine duyarlı ATP ile bağlantılı solunum, proton kaçağı, FCCP ile belirlenen maksimum solunum ve rotenon ile ant imisine dirençli mitokondri dışı oksijen tüketimidir. Seahorse çıktılarının State 3 ve State 4 olarak adlandırılması, Agilent Mito Stress Test çerçevesinin açıkça gösterdiği üzere, preparatın desteklemediği bir kesinlik izlenimi yaratır.

Metilen mavisi, daha fazla oksijen ile daha fazla enerji arasındaki sezgisel bağlantıyı bozar. İzole beyin mitokondrileri çalışmasına göre, izole kobay beyin mitokondrilerinde 100 nM ile 1 uM arasındaki boya konsantrasyonları; glutamat ile malat, süksinat ve alfa-gliserofosfat substratlarıyla dinlenim durumundaki oksijen tüketimini artırmış, alfa-gliserofosfatta yaklaşık yüzde 64 artış sağlamıştır. Buna rağmen, sağlıklı mitokondrilerde ADP ile uyarılan solunum esasen değişmemiştir. Kaçak solunum artarken ADP ile uyarılan akış sabit kaldığı için hesaplanan solunum kontrol oranı düşer. Bu düşüş, boyanın mitokondrilere zarar verdiği anlamına gelmez. Boyanın normal solunuma ek olarak oksijen tüketen bir redoks döngüsü oluşturduğu anlamına gelir. Yalnızca artışı bildiren bir metilen mavisi oksijen tüketimi analizi, gerçek bir kimyasal süreci ölçmüş olur ancak enerjinin korunması hakkında hiçbir şey söylemez.

İşlevi geri kazandırma deneyleri, aynı farkı daha büyük ölçekte gösterir. Kompleks I bloke edildiğinde oksijen akışı yaklaşık üç katına çıkarken ATP sentezi yalnızca yaklaşık 1.5 katına çıkmıştır. Elektroda daha fazla oksijen ulaşmıştır. Bunun daha küçük bir bölümü ATP üretimine katkıda bulunmuştur. Oksidatif fosforilasyonun iyileştiğine ilişkin her iddia, ATP ölçümünü de gerektirir; ideal olarak bu ölçüm, paydanın hangi tanıma göre hesaplandığı belirtilen bir oksijen başına ATP oranıyla ifade edilmelidir.

ATP analizleri sentez hızını ölçer; ATP miktarı bunun yerini tutamaz

Bir ATP analizi farklı bir soruyu yanıtlar: birim zamanda ne kadar ATP üretilir? Dakikalar boyunca izlenen ateş böceği lusiferaz lüminesansı veya 340 nm'de okunan eşlenik heksokinaz ve glukoz-6-fosfat dehidrogenaz analizi gibi kinetik bir ölçüm, hız verir. Tek bir son nokta toplam ATP ölçümü ise miktarı verir. Bu miktar, sentez ile tüketim arasındaki farkı yansıtır ve tek başına oksidatif fosforilasyon hakkında çok az bilgi sağlar.

Budapeşte grubu, adenilat kinazın baskılandığı eşlenik enzimatik yöntemi kullanmış ve 1 ile 2 uM arasındaki metilen mavisinin, rotenon uygulanmış ve antimisin uygulanmış mitokondrilerde ATP üretimini sınırlı ancak anlamlı ölçüde artırdığını bulmuştur. Bu, işlevin gerçekten geri kazanılmasıdır ve kısmi düzeydedir. TEGDMA toksisitesi çalışması, farklı bir modelde benzer bir sonuca ulaşmıştır: 5 mM dental monomer TEGDMA, Kompleks I ile bağlantılı solunumu yaklaşık 286 akış biriminden 28'e düşürmüş, 2 uM boya ise bunu yaklaşık 86'ya yükseltmiştir.

Renkli bir redoks bileşiğiyle çalışırken iki kontrol zorunludur. İlk olarak, ölçülen ATP sentezinin ne kadarının ATP sentaza bağlı olduğunu belirlemek için oligomisin kullanın. İkinci olarak, bilinen miktarda ATP, tüm bileşenleri içeren reaktif ve deneyde kullanılan boya konsantrasyonlarının aynısıyla hücresiz bir ekleme sonrası geri kazanım testi yapın; en azından 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM ve 2 uM konsantrasyonlarını kullanın. Boya, yayılan ışığı soğurabilir, raportör enzimi inhibe edebilir veya reaktifin redoks kimyasını değiştirebilir. Genel lusiferaz analizi rehberi de tam olarak bu tür girişimler için biyokimyasal karşı tarama testleri önerir. Sönümleme genellikle yüksek konsantrasyonlarda daha kötü olduğu için 1 uM'nin artefaktsız olduğunu varsaymayın.

Membran potansiyeli probları akışı değil, boya dağılımını ölçer

Safranin O, TMRM ve TMRE, rodamin 123 ve JC-1'in tümü membranı geçebilen katyonlardır. Elektrokimyasal dengeye göre negatif yüklü matrikste birikirler. Bu nedenle toplam floresans, probun nerede bulunduğu üzerinden potansiyeli dolaylı olarak bildirir. Hiçbiri ATP'yi veya elektron akışını ölçmez.

Her probun daha uygun olduğu bir preparat vardır. Safranin O, izole mitokondriler ve geçirgenleştirilmiş hücreler için uygundur. Genellikle yaklaşık 2 uM konsantrasyonda, yaklaşık 495 nm uyarma ve 585 nm emisyon dalga boylarıyla kullanılır; probun içeri alınmasının toplam floresansı değiştirdiği bir sönümleme rejiminde çalışır. TMRM ve TMRE, bütünlüğü korunmuş hücrelerde düşük nanomolar yüklemeyle ve sönümlemenin olmadığı modda kullanıma uygundur. Bu modda depolarizasyon boyanın salınmasına neden olur ve mitokondriyal floresans azalır; yüksek yüklemede ise öz sönümleme nedeniyle sinyalin yönü tersine dönebilir. JC-1, kullanışlı bir yeşil/kırmızı oranı verir ancak yüklemeye ve mitokondri kütlesine bağlıdır. Bu nedenle nicel çalışmalar için dikkatle kontrol edilen TMRM'den daha zayıf bir seçenektir. Bu avantajlar ve sınırlamalar, yaygın olarak kullanılan bir mitokondriyal membran potansiyeli probları derlemesinde özetlenmiştir.

Metilen mavisi, tam da çalışma konsantrasyonlarında optik girişime neden olur. Yaklaşık 600 ile 665 nm arasındaki soğurma bantları, kırmızı prob emisyonuyla örtüşür. Bu nedenle iç filtre etkileri, sönümleme ve uyarma ışığının soğurulması olasıdır. Boya ayrıca, kendi dağılımı ölçülen potansiyele göre değişen ikinci bir lipofilik katyondur. Buna karşı önlem, birden fazla ölçüm yöntemi ve kör kontroller kullanmaktır: yalnızca prob, yalnızca boya, prob ile her boya konsantrasyonu, sıfır referansı olarak FCCP ile tam depolarizasyon ve ideal olarak optik özellikleri farklı ikinci bir prob. Kompleks III'ü baypas etme çalışması, antimisin ve miksotiyazol inhibisyonundan sonra membran potansiyelinin geri kazanılmasını hem safranin O hem de TMRM ile tekrar ölçüp aynı niteliksel geri kazanımı göstererek bu yaklaşım için örnek oluşturmuştur. Tek bir optik raportör bir ipucudur. İki bağımsız raportör ise kanıttır.

Üç preparat, üç farklı soru

İzole mitokondriler, geçirgenleştirilmiş hücreler ve bütünlüğü korunmuş hücreler, tek bir analizin birbirinin yerine kullanılabilen duyarlılık ayarları değildir. Bunlar, farklı işleyiş ilkelerine sahip farklı kavramlardır.

İzole mitokondriler; plazma membranını, sitozolü ve ağ mimarisini ortadan kaldırırken elektron taşıma zincirini, iç membranı ve matriksteki işlevsel mekanizmaları korur. Bu bileşenlerin ortadan kaldırılması yöntemin amacıdır: substratlar, ADP, inhibitörler ve boya konsantrasyonları kesin olarak tanımlanır, böylece ilgili yol belirlenebilir. Bunun bedeli, doğal substrat tedarikinin, sinyalleşmenin ve enerji talebinin kaybıdır.

Geçirgenleştirilmiş hücreler, dışarıdan eklenen substratların ve ADP'nin açılmış plazma membranından geçmesine izin verirken mitokondrileri hücresel mimarilerinin büyük bölümü içinde tutar. Hücresel bağlamda bir substrat yolundaki kusuru belirlemek için uygun araçtır. Aşırı geçirgenleştirme dış membrana zarar verir ve sitozolik düzenleyici bileşenler ortamdan uzaklaşır.

Bütünlüğü korunmuş hücreler her şeyi korur: plazma membranı bariyerini, sitozolik indirgeyicileri, endojen substrat taşınmasını, mitokondriyal ağı ve ATP talebini. Fizyolojiye en yakın, mekanizmanın açıklanmasına ise en uzak preparattır; çünkü boyanın hücreye alınması, indirgenmesi ve belirli bölmelerde tutulması, mitokondrilerin maruz kaldığı etkin boya düzeyini birlikte şekillendirir.

TEGDMA çalışması, bu üç düzeyi bilinçli olarak kullanmıştır: boyayla oksidasyonun ve potansiyelin geri kazanılmasını incelemek için izole beyin mitokondrileri; hasarı esas olarak Kompleks I ile bağlantılı substrat oksidasyonuna lokalize etmek için geçirgenleştirilmiş diş pulpası kök hücreleri; baskılanmış oksijen tüketimi üzerinde 2 uM boyanın fizyolojik net etkisini değerlendirmek için bütünlüğü korunmuş kök hücreler. Farklı preparatlardaki mitokondriyal ölçümleri karşılaştıran okurlar için, metilen mavisinin elektronları solunum zinciri boyunca nasıl taşıdığına ilişkin tamamlayıcı açıklama, yolun arka planını sunar. Metilen mavisi solunum çalışmalarını okuma rehberi ise doz ve inhibitör mantığını ele alır.

Redoks aktif bir boyanın gerektirdiği kontroller

Bir redoks döngüleyicisi, sıradan bir inhibitörden daha uzun bir kontrol listesi gerektirir; çünkü yalnızca boyadan kaynaklanan kimyasal süreçler biyolojik süreçleri taklit edebilir.

Respirometri için, ölçüm kaymasını belirlemek üzere yalnızca tampon içeren bir hazne, biyolojik materyal içermeyen tampon ve boya haznesi, boya ile birlikte analizde bulunan her bir hücre dışı indirgeyici ve bütünlüğü korunmuş hücrelerde mitokondri dışı oksijen tüketimini tanımlamak için deney sonunda rotenon ile antimisin kullanın. İndirgenmiş boyanın, elektronları oksijene aktararak hidrojen peroksit oluşturması yoluyla yeniden oksitlendiğini dikkate alın. Bu nedenle, elektron vericisi bulunmayan yalnızca boya içeren bir kör kontrol, NADH veya NADPH mevcut olduğunda ortaya çıkan hücresiz oksijen tüketimini olduğundan düşük gösterir.

Hidrojen peroksit için, seçici olmayan DCFDA boyaları yerine kalibre edilmiş Amplex UltraRed ve yaban turpu peroksidazını tercih edin, katalazla doğrulama yapın ve boya bir fotosensitizan olduğundan aydınlatmaya bağımlılığı test edin. Beyin mitokondrileri çalışması, yalnızca 100 nM boya konsantrasyonunda peroksit yükünün dört kattan fazla arttığını, giderimin ise yavaşladığını ve peroksitin süperoksit ara ürünü olmadan doğrudan indirgenmiş boya tarafından oluşturulduğunu bulmuştur. Prob seçimi ve ışık kontrollerinin ayrıntıları, boya deneylerinde reaktif oksijen türlerinin ölçülmesi hakkındaki tamamlayıcı yazıda ele alınır. Peroksitin ne zaman sinyal, ne zaman yük olarak işlev gördüğüne ilişkin daha geniş soru ise hücresel redoks dengesi ve antioksidan iddiaları ile birlikte incelenir.

Yola ilişkin iddialar için, Kompleks III'ün her iki inhibitör bölgesini de test edin: Qi bölgesinde antimisin A ve Qo bölgesinde miksotiyazol. Ayrıca siyanürle bir Kompleks IV son nokta testi uygulayın. Daha önce yapılan bir fare beyni çalışması, boyanın rotenonla bloke edilmiş solunumu geri kazandırdığını, ancak antimisinle bloke edilmiş solunumu geri kazandırmadığını bildirmiştir. Daha sonra üç tür üzerinde yapılan çalışma ise her iki inhibitörle de kısmi geri kazanım ve doğrudan sitokrom c indirgenmesine ilişkin kanıt bulmuştur. Baypası kesinleşmiş bir mekanizma olarak değil, daha yeni verilerle uyumlu bir açıklama olarak değerlendirin; çünkü boya konsantrasyonu, inhibitör bölgesi, substrat durumu ve boya dağılımı, gözlenen yolu değiştirir.

Analiz seçimi matrisi

Bu tabloyu, ölçümü soruya göre seçmek için kullanın; soruyu ölçüme göre belirlemek için değil.

İkna edici bir iddia için asgari gereklilik; aynı boya konsantrasyonlarının, yani 100 nM, 300 nM, 1 uM ve 2 uM'nin, kaçak solunum, ADP, oligomisin ve ayırıcı koşullarında oksijen akışı; ATP sentez hızı; tercihen iki probla membran potansiyeli; katalaz ve hücresiz kontrollerle kalibre edilmiş peroksit salımı ölçümlerinin tamamında kullanılmasıdır. Birbiriyle bağlantılı ölçüm kümesini bildirin: oksijen akışı, ATP hızı, oksijen başına ATP, potansiyel ve peroksit. Bu sayıların herhangi biri tek başına, anlamı henüz belirlenmemiş bir ölçümdür.