Metilen mavisi ve nitrik oksit: NOS, cGMP ve damarsal sinyal iletimi

Soru basit görünüyor: Metilen mavisi nitrik oksidi inhibe eder mi? Laboratuvarda bu soru dört ayrı soruya ayrılır ve her biri farklı bir deneysel test gerektirir. Bunların birbirine karıştırılması, metilen mavisi ve nitrik oksit hakkındaki yazıların kendinden emin ama belirsiz görünmesinin başlıca nedenidir.

Nitrik oksit sinyalini dört halkalı bir zincir olarak düşünün. Nitrik oksit sentaz üretmek için bir genin transkripsiyonu gerçekleşir. Enzim, arjinini nitrik okside dönüştürür. Gaz, başka bir şeyle tepkimeye girmeden önce hedefine difüze olur. Çözünür guanilat siklaz onu algılar ve siklik GMP üretir. Metilen mavisinin her halkada etkileri olduğuna ilişkin yayımlanmış bulgular vardır; ancak kanıtlar farklı deneysel preparatlardan, farklı konsantrasyonlardan ve farklı izoformlardan gelir. Bir halkadaki sonuç, başka bir halkada etki olduğunu kanıtlamaz.

Temel zincirin açık anlatımı

Bir kan damarı duvarında standart süreç şöyle ilerler. Bir uyaran, endotel hücresine etki eder. eNOS veya NOS3 olarak adlandırılan endotelyal nitrik oksit sentaz, kısa süreli ve küçük miktarda nitrik oksit üretir. Gaz, komşu düz kas hücresine difüze olur, çözünür guanilat siklazın indirgenmiş demir içeren hem grubuna bağlanır ve GTP'nin siklik GMP'ye dönüşümünü hızlandırır. Siklik GMP, protein kinaz G'yi aktive eder, kalsiyumun hücre içindeki düzenlenişi değişir ve kas gevşer.

Ayrı tutulması gereken ikinci bir zincir vardır. Enfeksiyon veya sitokin maruziyeti sırasında hücreler, NOS2 olarak da adlandırılan indüklenebilir nitrik oksit sentazın, yani iNOS'un genini transkribe eder. Bu enzim, eNOS'a kıyasla daha yüksek miktarda ve daha uzun süreli nitrik oksit akışı oluşturur. Üçüncü bir izoform olan nöronal NOS, yani nNOS, başka bir bağlamda yer alır. Bir makale izoformu belirtmeden nitrik oksit sentazdan söz ediyorsa durup hangisinin ölçüldüğünü kontrol edin. Metilen mavisinin elektronları nasıl aktardığına ilişkin genel bakış, genel olarak redoks hedefleri için de aynı noktayı vurgular: Elektron aktarım aracısı tek başına bir şey yapmaz; sonucu, aktarımın her iki ucundaki etkileşim ortakları belirler.

Ölçülen siklik GMP de doğrudan bir enzim testi değil, birden fazla süreci yansıtan bütünleşik bir ölçümdür. Düzeyi, siklaz tarafından sentezlenen miktardan fosfodiesterazların, özellikle damar düz kasındaki PDE5'in parçaladığı miktarın çıkarılmasıyla belirlenir. Bu nedenle siklik GMP'deki düşüş, algılayıcıya daha az sinyal ulaştığı anlamına gelir. Tek başına hangi halkanın aksadığını göstermez.

Halka 1: daha az iNOS enzimi üretilir

Bakteriyel lipopolisakkarit, interferon gama veya her ikisiyle uyarılan fare makrofajlarında metilen mavisi, makrofaj transkripsiyon deneylerinde iNOS proteininde beklenen artışı önledi ve iNOS haberci RNA'sını güçlü biçimde baskıladı. Burada bilgi veren nokta, nelerin değişmediğidir. İnhibitör I kappa B alfa'nın yıkımı, NF kappa B ve STAT1'in fosforilasyonu ve bu faktörlerin çekirdeğe taşınması büyük ölçüde korunmuştu. Azalan şey, bu faktörlerin DNA'ya bağlanmasıydı; kromatin immünopresipitasyonu da iNOS promotöründe daha az bağlanma olduğunu doğruladı.

Bu, mevcut bir enzimin akut blokajı değil, enzim miktarını belirleyen sürecin öncesinde gerçekleşen bir gen düzenleme etkisidir. Protein ortaya çıkmadan önce transkripsiyon faktörlerinin bir promotöre bağlanması gereken inflamatuvar sinyal iletimi bağlamına aittir. Dinlenim durumundaki bir damarda bulunan konstitutif eNOS hakkında doğrudan bir şey söylemez ve bu sınırlar içinde tanımlanmalıdır.

Halka 2: mevcut NOS enzimi daha yavaş çalışır

Bir sıçan çalışması farklı bir düzeyi test etti. Bilinci açık erkek sıçanlara intravenöz lipopolisakkarit verildi; üç saat sonra intravenöz olarak ya serum fizyolojik ya da kg başına 3 mg metilen mavisi uygulandı. Medial bazal hipotalamustaki nitrik oksit sentaz aktivitesi, hipotalamik NOS aktivitesi çalışmasında işaretli arjininin sitrüline dönüşümüyle ölçüldü. Yalnızca stres ve serum fizyolojik bir miktar kalsiyumdan bağımsız aktiviteyi indüklerken lipopolisakkarit bunu kontrol düzeyinin yaklaşık on katına çıkardı. Metilen mavisi, indüklenen her iki bileşeni de ortadan kaldırdı. O dokuda, o dozda ve o zaman noktasında kalsiyuma bağımlı konstitutif aktivite değişmedi.

Bu sonucu tam olarak ifade edildiği sınırlar içinde okuyun: Belirtilen koşullarda ölçülen iNOS tipi aktivite baskılandı. Bu, gen ekspresyonunun ölçümü değildir; iNOS'a yönelik seçiciliğin eNOS veya nNOS karşısında her zaman korunduğunun kanıtı da değildir. Saflaştırılmış enzim çalışmaları bu ihtiyatı daha da gerekli kılar. Saflaştırılmış nitrik oksit sentazın doğrudan testlerinde metilen mavisi, 30 mikromolarda sitrülin oluşumunu tamamen bloke etti. Yarı inhibisyon konsantrasyonu, süperoksit dismutaz olmadan yaklaşık 5.3 mikromolar, süperoksit dismutaz varken ise 9.2 mikromolardı; bu bulgular saflaştırılmış NOS ve guanilat siklaz karşılaştırmasında bildirildi. Saflaştırılmış nNOS ile yapılan ayrı bir çalışma, enzime bağlı hem grubunun oksidasyonunun rol oynadığını gösterdi. Buradan çıkarılacak pratik ders şudur: İzole sistemlerde doğrudan NOS inhibisyonu vardır; ancak hipotalamus sonucu, metilen mavisinin her yerde tüm konstitutif NOS enzimlerini etkilemeden bıraktığına ilişkin genel bir iddiaya genişletilemez.

Halka 3: nitrik oksit hedefine ulaşmadan kaybolur

Siklik GMP'deki bir düşüşün enzim blokajı dışındaki bir mekanizmayla açıklanabileceğinin en açık gösterimi, kültürdeki tavşan pulmoner arter düz kas hücrelerinden gelir. Deney tasarımında nitrik oksit donörleri doğrudan eklenerek endojen NOS tamamen devre dışı bırakıldı; ardından damar düz kasında süperoksit çalışmasında metilen mavisinin siklik GMP yanıtını yine de baskılayıp baskılamadığı incelendi.

1 ile 100 mikromolar arasında üç donör test edildi: S nitrozo L sistein, sodyum nitroprussid ve MPANO adı verilen kararlı bir deamine analog. Hepsi siklik GMP'yi yaklaşık 1.5 kat ile 12 kat arasında artırdı. 10 mikromolar metilen mavisi, ilk ikisinin etkisini yüzde 51 ile 100 arasında inhibe etti ve MPANO yanıtını değiştirmedi. Metilen mavisi yalnızca siklazın katalitik bölgesini bloke ediyor olsaydı bu donör seçiciliğini açıklamak güç olurdu; çünkü üçünün de etkisi yolun devamındaki aynı enzimde birleşir.

Ardından üç kontrol, mekanizmanın süperoksitle ilişkisini ortaya koydu. İlk olarak, ksantin ve ksantin oksidaz ile hücre dışı süperoksit üretilmesi aynı örüntüyü oluşturdu: CYSNO ve nitroprussid yanıtları bloke edilirken MPANO yanıtı korundu. İkinci olarak, metilen mavisi düz kas hücrelerinde doza ve zamana bağlı süperoksit üretimine yol açtı; bu üretim sitokrom c indirgenmesiyle ölçüldü. Üçüncü olarak, süperoksit dismutaz inhibisyonu tamamen önlerken katalaz önlemedi. Bu da o preparatta etkiye doğrudan aracılık eden türün hidrojen peroksit değil, süperoksit olduğunu gösterir.

Deneyin ortak kültür versiyonunu açıklamak yararlıdır; çünkü etkinin nerede gerçekleştiğini gösterir. Lameller üzerindeki endotel hücreleri, düz kas hücreleriyle kısa süreli olarak birlikte kültüre edildi. Böylece bazal olarak salınan endotelyal faktör, düz kas hücrelerindeki siklik GMP'yi üç ila sekiz kat artırdı. Her iki hücre grubundan birine önceden metilen mavisi uygulanması bu sinyali azalttı ve süperoksit dismutaz, endotel hücrelerine yapılan ön uygulamanın etkisini kısmen geri çevirdi. Başka bir deyişle metilen mavisinin, sinyali algılayan düz kas hücresinin içinde etki etmesi gerekmez. İletim sırasında haberciyi ortadan kaldırarak sinyali azaltabilir. Metilen mavisi araştırmalarını okuma rehberi bunu genel bir kural olarak ele alır: Moleküler hedefi adlandırmadan önce müdahalenin gerçekleştiği bölmeyi belirtin.

Bunu NOS inhibisyonu olarak adlandırmak yanlış olur. Donörlerin etkili olması için hiçbir sentaz basamağı gerekmiyordu; buna rağmen sinyal azaldı.

Halka 4: algılayıcının kendisi daha az yanıt verir

Çözünür guanilat siklaz üzerinde doğrudan etkiler vardır, ancak konsantrasyonlar önemlidir. Yukarıda atıfta bulunulan saflaştırılmış enzim karşılaştırmasında, nitrik oksitle uyarılan siklazın yarı inhibisyonu için yaklaşık 60 mikromolar metilen mavisi gerekirken NOS'un yarı inhibisyonu yaklaşık 5 ile 9 mikromolar arasında gerçekleşti. Üstelik 1 milimolar bile yalnızca kısmi bir maksimum blokaj sağladı. Bu, yaklaşık altı ila on bir katlık bir farktır. Dolayısıyla düşük mikromolar konsantrasyonda siklik GMP'yi azaltan bir hücre deneyi, yalnızca siklik GMP ölçümüne dayanarak seçici siklaz inhibisyonu olarak tanımlanamaz.

Daha sonraki bir redoks çalışması ikinci bir ihtiyat noktası ekledi: Metilen mavisi, nitrik oksitle aktive edilmiş siklazı, hem demirinin havayla basit oksidasyonundan farklı bir mekanizmayla deaktive etti. Dolayısıyla algılayıcının işlevi bozulabilir; ancak kimyasal mekanizma kesinleşmiş değildir. Konsantrasyon farkı da düşük mikromolar maruziyetlerde önce süperoksit ve NOS etkilerinin dışlanması gerektiği anlamına gelir. Fosfodiesteraz kontrolü de burada devreye girer. Yıkım ölçülmediği veya bloke edilmediği sürece, siklik GMP birikiminin azalması daha az sentezle, daha hızlı yıkımla veya her ikisiyle uyumludur.

Neden bu bulgular kan basıncıyla ilgili tek bir iddiaya indirgenemez?

Her halka farklı bir sistemde ortaya kondu. Makrofaj transkripsiyonu, hipotalamik enzim aktivitesiyle aynı şey değildir. Lipopolisakkarit sonrasındaki hipotalamik aktivite, dinlenim durumundaki endotelyal tonusla aynı şey değildir. Ortak kültürde bazal olarak salınan endotelyal faktör, agonistle uyarılan vazodilatasyonla aynı şey değildir. 10 mikromolar metilen mavisine maruz bırakılan kültürdeki pulmoner arter hücreleri, insan dolaşımıyla aynı şey değildir. Bunları, metilen mavisinin nitrik oksidi bloke ederek kan basıncını yükselttiği gibi bir ifadede birleştirmek, kontrollerin özellikle korumak için tasarlandığı ayrımları ortadan kaldırır.

Üç kontrol, açıklamanın kanıtlara bağlı kalmasını sağlar. İlk olarak izoformu belirtin: Dinlenim durumundaki damar tonusu için eNOS, indüklenen inflamatuvar akış için iNOS, nöronal bağlamlar ve bazı saflaştırılmış enzim bağlamları için nNOS. İkinci olarak nitrik oksit sinyalinin nasıl sağlandığını belirtin: Endojen sentez, bazal endotelyal salınım veya CYSNO, nitroprussid ya da MPANO gibi belirli bir donör. Çünkü kararlı donör metilen mavisinin etkisine direnç gösterirken kararsız donörler göstermedi. Üçüncü olarak konsantrasyonu ve etkiyi geri çeviren müdahaleyi belirtin: Süperoksit dismutazın etkiyi geri çevirmesi süperoksitin rolünü gösterir; katalazın başarısızlığı, o preparatta hidrojen peroksitin rolüne karşı kanıt sunar; ksantin oksidazın etkiyi taklit etmesi, süperoksitin bu etkiyi oluşturmak için yeterli olduğunu gösterir; saflaştırılmış enzim testleri ise kataliz üzerindeki doğrudan etkileri iletim sırasındaki kayıplardan ayırır.

Bulguların kısa sentezi şöyledir. Metilen mavisini, seçici bir siklaz blokerinden ziyade nitrik oksitten siklik GMP'ye uzanan sinyal iletimini birden fazla noktada değiştiren bir madde olarak ele almak daha uygundur. Preparata ve konsantrasyona bağlı olarak iNOS transkripsiyon faktörlerinin bağlanmasını azaltabilir, NOS enzimlerini doğrudan inhibe edebilir, süperoksit üretimi yoluyla nitrik oksit kullanılabilirliğini azaltabilir ve nitrik oksitle aktive edilmiş siklazın işlevini bozabilir. Damar çalışmalarında siklik GMP sinyal iletiminin rolü ve hücre testlerinde kullanılan nitrik oksit donörlerinin karşılaştırılması bu dalların birer tanesini daha ayrıntılı ele alır. Redoks etkilerini enzim etkilerinden ayırmak için kullanılan yöntemler ise süperoksit dismutaz, katalaz ve kararlı donör kontrolünün bu literatürde neden bu kadar sık birlikte kullanıldığını açıklar.

Metilen mavisi sonrasında düşük bir siklik GMP değeri, zincirde bir kopukluk olduğunu gösterir. Hangi halkanın koptuğunu yalnızca kontroller ortaya koyar.