Metilen mavisi ve ışığa maruz kalma: dalga boyu, ışınım yoğunluğu ve uygulama geometrisi

İki makale, metilen mavisinin cm kare başına 10 J ışığa maruz bırakıldığını bildiriyor. Birinde bakteriler ölüyor. Diğerinde ölçülebilir bir etki görülmüyor. Yalnızca dozu karşılaştıran bir okur, alanın tutarsız olduğu sonucuna varıyor. Oysa alan tutarlı. Doz, hiçbir zaman maruziyetin tamamını tanımlamıyordu.

Işığa maruz kalma, birlikte işleyen parametrelerden oluşan küçük bir sistemdir: dalga boyu, ışınım yoğunluğu, süre, bunların sonucunda ortaya çıkan fluens, oksijen mevcudiyeti, boyanın konsantrasyonu ve agregasyon durumu, boya ile ışık arasındaki zamanlama ve ışığın numune içinde gerçekten katettiği optik yol. Bunlardan birini değiştirdiğinizde fotokimya da değişir. Bu yazı her parametreyi ele alıyor, ardından yakın kızılötesi fotobiyomodülasyon ile boyanın doğrudan fotoaktivasyonunu ayırt ediyor; çünkü en sık karıştırılan iki rejim bunlardır.

Dalga boyu, boyanın sürece katılıp katılmayacağını belirler

Sudaki metilen mavisi, monomer hâlinde kırmızı ışığı güçlü biçimde soğurur; soğurma tepesi 664 ile 665 nm civarındadır. Boya dimerler ve daha büyük yığınlar oluşturacak şekilde agregasyona uğradıkça, 610 nm civarındaki daha kısa dalga boylu omuz büyür. Tepe yakınındaki molar sönüm katsayısı 65,000 ile 85,000 M-1 cm-1 mertebesindedir; dolayısıyla mikromolar çözeltiler bile yoğun mavi renktedir. Erken dönem metilen mavisinin DNA ve biyolojik substratlarla fotokimyasını inceleyen derleme, bu soğurma davranışını ve ardından gelen uyarılmış hâl kimyasını belgeliyor: soğurma, kısa ömürlü bir singlet hâlin oluşmasını sağlar; buradan, bildirilen verimi yaklaşık 0.5 olan bir geçişle daha uzun ömürlü bir triplet hâle geçilir. Bu triplet hâl, hava ile temas eden çözeltide yaklaşık 2 mikrosaniye içinde oksijen tarafından söndürülür.

İki fotokimyasal yol, bu söndürme adımında ayrılır. Tip II kimyasında triplet hâldeki boya, temel hâldeki oksijene enerji aktarır ve yaygın olarak belirtilen yaklaşık 0.52 verimle singlet oksijen üretir. Tip I kimyasında ise triplet hâl, bir substrata elektron veya hidrojen aktararak süperoksit ve hidroksil türleri dâhil radikaller üretir. İkisi aynı anda işleyebilir ve Tip I katkıda bulunsa bile geleneksel fotodinamik etki oksijene güçlü biçimde bağımlı kalır.

Metilen mavisi için dalga boyu seçimi açısından sonuç basit bir kuraldır. Yaklaşık 630 ile 680 nm arasındaki kırmızı ışık, boyanın soğurma bandıyla örtüşür; 660 ile 665 nm, monomerin maksimumuna yakındır. Bu nedenle kayda değer miktarda boyanın bulunduğu her yerde ışığa duyarlılaştırıcı kimyasını tetikleyebilir. 810 nm'deki yakın kızılötesi ışık, temel hâl soğurma bandının oldukça dışında kalır; dolayısıyla boyayı doğrudan uyarmak için uygun bir dalga boyu değildir. Konsantrasyon, tabloyu önemli bir açıdan karmaşıklaştırır: konsantrasyon arttıkça boyanın daha büyük bir kısmı, 610 nm'ye doğru soğuran ve molekül başına daha düşük verimle ışığa duyarlılaştıran dimerik ve agregat biçimlerde bulunur. Bu yüzden boya miktarını iki katına çıkarmak etkiyi iki katına çıkarmaz. Metilen mavisi ve kırmızı ışık tedavisine ilişkin tamamlayıcı derleme, bu soğurma kuralını ışığa duyarlılaştırılmış her reaksiyonun ön koşulu olarak ele alır.

Işınım yoğunluğu, süre ve fluens tek değil, üç parametredir

Cm kare başına J cinsinden fluens, ışınım yoğunluğunun zamanla çarpımıdır. Yalnızca fluensi bildirmek, enerjinin hangi hızla ulaştığını gizler; oysa bu hız önemlidir.

Kısa süreyle uygulanan yüksek ışınım yoğunluğu ile uzun süreyle uygulanan düşük ışınım yoğunluğu, farklı kimyasal süreçlerle aynı fluensi verebilir. Yüksek ışınım yoğunluğu, çözünmüş oksijeni difüzyonla yerine konduğundan daha hızlı tüketir; bu da maruziyet devam ederken oksijene bağımlı Tip II yolunu sınırlar. Ayrıca ısı birikimine yol açar ve doku, ısınmaya hem oksijenlenmeyi hem de boya dağılımını değiştiren kan akışı değişiklikleriyle yanıt verir. Uzun maruziyet boyunca düşük ışınım yoğunluğu, oksijen tedarikini sürdürür; ancak onarım ve yeniden oksijenlenme süreçlerine maruziyet sırasında etkili olmaları için zaman da tanır. Fotokimya ders kitapları, yalnızca toplam dozun önemli olduğu varsayımını karşılıklılık ilkesi olarak adlandırır. Oksijen, ısınma veya biyoloji devreye girdiğinde bu ilke geçerliliğini yitirir; dokuda bu, neredeyse her zaman demektir.

İnsanlarda metilen mavisi kullanılan antimikrobiyal fotodinamik uygulamalarda yaygın olarak cm kare başına 6 ile 18 J kullanılır; bu aralık fotobiyomodülasyon değerleriyle örtüşür. Bu nedenle tek başına fluens, rejimi tanımlayamaz. Boya içeren dokuya 660 nm'de cm kare başına 10 J uygulanması, ışığa duyarlılaştırıcının yönlendirdiği bir fotokimyadır. Eser miktarda boya içeren dokuya 810 nm'de aynı fluensin uygulanması ise tamamen farklı bir şeydir. Sayı aynıdır. Kavram farklıdır.

Optik yol ve numune geometrisi, ışığın neyle karşılaşacağını belirler

Beer-Lambert davranışı, numunenin ön kısmının arka kısmından çok daha fazla ışık alması demektir. Onlarca mikromolar boya içeren bir küvette ilk milimetre, gelen kırmızı ışığın büyük bölümünü soğurabilir; böylece daha derindeki katmanlar fiilen ışığa maruz kalmaz. Aynı çözeltinin düşük hacimde, sığ bir kuyucuğa alınmasıyla maruziyet neredeyse homojen hâle gelir. Aynı boya, aynı lamba, yüzeyde aynı fluens; farklı sonuç.

Dokuda soğurmaya saçılma da eklenir. 660 nm civarındaki kırmızı ışık milimetreler mertebesinde nüfuz eder; kesin derinliği kan içeriği, pigmentasyon ve doku türü belirler. Kuyucuklar da kendilerine özgü artefaktlar ekler: menisküsün mercek etkisi, duvarlardan yansıma, kenar kuyucukların gölgede kalması ve kaynak altında küçük hacimlerin ısınması. Aynı lamba ayarlarını, ancak farklı plaka türlerini, hacimleri veya kaynak mesafelerini bildiren iki laboratuvar, farklı deneyler yapmıştır.

Mesafe özellikle vurgulanmalıdır; çünkü en yaygın gözden kaçan değişkendir. Işınım yoğunluğu, kolime edilmemiş bir kaynaktan uzaklaştıkça hızla düşer. Bu nedenle plakanın 2 cm üzerindeki bir lambanın 5 cm yüksekliğe taşınması, yöntemler bölümü aynı kalmasına rağmen ışınım yoğunluğunu birkaç kat azaltabilir. Numune yüzeyinde ölçülmüş bir ışınım yoğunluğu olmadan, üreticinin güç değerlerinden hesaplanarak yayımlanan fluensler ölçüm değil, tahmindir.

Açıklamalı parametre rehberi: bir maruziyeti tekrarlanabilir kılan unsurlar

Bu sayfanın özgün materyali bir kontrol listesidir. Bu maddeleri eksik bırakan herhangi bir çalışma ışık maruziyeti, öne çıkarılan doz ne kadar benzer görünürse görünsün başka bir maruziyetle karşılaştırılamaz.

1. Dalga boyu ve bant genişliği. Renk adı değil, tepe ve tam genişlik. Kırmızı LED, boyanın soğurmasının büyük ölçüde değiştiği 630 ile 680 nm aralığını kapsar.
2. Numune yüzeyinde ölçülmüş ışınım yoğunluğu; cm kare başına mW cinsinden. Üreticinin watt değeri ışınım yoğunluğu değildir.
3. Süre ve darbeli uygulama. Sürekli veya darbeli uygulama; uygun olduğunda darbe frekansı ve görev döngüsü dâhil.
4. Yukarıdaki ölçülmüş değer çiftinden hesaplanan fluens; cm kare başına J cinsinden.
5. Boya konsantrasyonu, formülasyonu ve agregasyon durumu. 664 nm civarındaki monomer, 610 nm civarındaki agregatlardan farklı biçimde ışığa duyarlılaştırır.
6. İlaç-ışık aralığı. Boyanın uygulanması ile ışınlama arasındaki dakikalar veya saatler; ışık geldiğinde boyanın nerede bulunduğunu belirler.
7. Oksijenlenme. Hava ile temas eden çözelti ile hipoksik doku arasındaki fark, Tip I ve Tip II dengesini doğrudan değiştirir.
8. Geometri. Numune derinliği, hacim, kap türü, kaynağın mesafesi ve açısı ile dokudaki hedef derinliği.

Makaleleri okurken yararlı bir alışkanlık: önce ilaç-ışık aralığını kontrol edin. Bu aralık amacı ortaya koyar. Fotodinamik tasarımlar, boya içeren dokuyu bilinçli olarak ışınlar. Kombinasyon tasarımları ise aşağıdaki örneklerde olduğu gibi ikisini bilerek ayırabilir.

Yakın kızılötesi fotobiyomodülasyon, boyanın fotoaktivasyonu değildir

Genellikle PBM olarak kısaltılan fotobiyomodülasyon, ışığa duyarlılaştırıcı eklemeden endojen sinyalleşmeyi düzenlemek için kırmızı veya yakın kızılötesi ışık kullanır. Genellikle PDT olarak kısaltılan fotodinamik tedavi, üç bileşeni birlikte kullanır: duyarlılaştırıcının soğurduğu ışık, duyarlılaştırıcının kendisi ve hedefe zarar veren reaktif türlerin ani üretimini sağlayan oksijen. Mitokondrileri nöroproteksiyon hedefi olarak ele alan bir derleme, metilen mavisini PBM ile birlikte değerlendirir; çünkü hücresel solunum üzerinde farklı yönlerden birleşirler: boya, elektron akışını destekleyen katalitik bir redoks döngüleyicisi olarak işlev görürken, PBM'nin Kompleks IV'teki sitokrom c oksidazdan inhibitör nitrik oksidin ayrılmasını desteklediği varsayılır. Bu enzim mekanizması hipotez olarak belirtilmeye devam edilmelidir.

En çok atıf alan iki kombinasyon fare çalışmasının ikisi de 810 nm ışık kullanır; boyanın fotoaktivasyonunu göstermemelerinin nedeni tam olarak budur. Bir uyku yoksunluğu öncesi uygulama çalışmasında, farelere yoksunluk öncesinde günlük kg başına 0.5 mg metilen mavisi, gün aşırı 810 nm darbeli lazer veya ikisi birden uygulandı. Birlikte yapılan ön uygulama, bellekle ilişkili davranışları ve hipokampal sinaptik proteinleri korurken tekil uygulamalar büyük ölçüde başarısız oldu. Bir eş zamanlı tedavi kullanılan kronik stres çalışmasında, farelere günlük kg başına 0.5 mg boya ile birlikte cm kare başına 8 J düzeyinde 810 nm PBM uygulandı. Özellikle boya içeren dokuyu ışınlamamak için önce lazer uygulandı ve boya iki saat sonra enjekte edildi. Üç çalışma kolunun tümü öğrenme bozukluklarını tersine çevirdi; ek yarar ağırlıklı olarak serum kortizolü ve beyindeki reaktif oksijen türlerinde görüldü. Bu sonuçlar, birlikte kullanılan iki mitokondriyal müdahaleyi sınar; fotodinamik çalışma koleksiyonu, her endikasyon için dalga boyunu kaydederek bu ayrımı görünür tutar.

Deriye ilişkin kanıtlar ise diğer taraftadır. İnsanlarda metilen mavisi ile ışığın birlikte kullanıldığı deri verileri, topikal veya lezyon içi boya ve yıkıcı ya da yeniden şekillendirici bir amaçla, 630 ile 680 nm aralığında kümelenir; bu, tanımı gereği PDT'dir. Bu giderilme sonucunu boyanın PBM'yi güçlendirdiğinin kanıtı olarak göstermek veya farelerde 810 nm ile sağlanan düzelmeyi, 660 nm bir panel ile boyanın bilişsel işlevlere yönelik bir protokol olduğunun kanıtı saymak, rejimleri birbirine karıştırır. Dozlama ve farmakoloji referansı ile güvenlik ve etkileşim rehberi, bu konunun konsantrasyon ve kontrendikasyonlarla ilgili kısımlarını daha ayrıntılı ele alır.

Sayıları karşılaştırmadan önce kavramı adlandırın. Dalga boyu, boyanın ışığı soğurup soğurmayacağını belirler. Işınım yoğunluğu ve süre, kimyanın bu soğurmayla ne yapacağını belirler. Geometri, numunenin hangi kısmının bunlardan herhangi birine maruz kalacağını belirler. Bir parametresi aynı, diğerleri farklı olan iki maruziyet, farklı deneylerdir; bunları birbirinin yerine kullanılabilir saymak, bu rehberin önlemeyi amaçladığı hatadır. Bunların hiçbirinden evde uygulanacak bir protokol çıkmaz; dalga boyu uyumlu ışık ile sistemik boya, başka koşullarda düzenleyici olan bir maruziyeti ışığa duyarlılaştırıcının yönlendirdiği fotokimyaya dönüştürür ve bu, klinik uzmanların sorumluluğundadır.