Metilen mavisi deneylerinde reaktif oksijen türlerinin ölçülmesi

İki laboratuvar, her birinin metilen mavisi antioksidan deneyi olarak adlandırdığı bir çalışma yürütür. Biri boyanın reaktif oksijen türlerini baskıladığını bildirir. Diğeri ise bunları ürettiğini bildirir. İkisi de düzgün doz-yanıt eğrileri sunar. İkisi de samimidir. Farkın nedeni sahtekârlık ya da yetersizlik değildir. İki grup, farklı soruları yanıtlayan problarla, farklı ışık koşullarında farklı şeyler ölçmüş ve sonra her iki yanıtı da aynı sözcükle tanımlamıştır: ROS.

Metilen mavisini hassas biçimde ölçmek zordur; çünkü gözlemlemesi beklenen kimyaya kendisi de katılır. Karanlıkta, elektronları vericiler ile alıcılar arasında taşır ve başlangıç formuna dönerek yeniden döngüye girmeye hazır hâle gelir. Işık altında ise bir fotosensitizöre dönüşür; uyarılmış triplet duruma geçer ve bu durumdan oksijene enerji aktararak singlet oksijen oluşturabilir ya da elektron aktararak radikaller ve hidrojen peroksit üretebilir. Bu sisteme eklenen herhangi bir prob, boyanın kendisi tarafından oksitlenebilir, indirgenebilir, soldurulabilir veya optik olarak maskelenebilir. Bu nedenle herhangi bir ROS ölçümünde ilk soru asla sayının ne olduğu değildir. İlk soru, analizin gerçekte neyi saptadığı ve boyanın analizi nasıl etkilediğidir.

Amplex Red: kalibre edilmiş bir hidrojen peroksit analizi

Metilen mavisi ile Amplex Red kombinasyonu, doğru kurulduğunda bu literatürde en sağlam biçimde savunulabilecek eşleşmedir. Kimya özgüldür: yaban turpu peroksidazı, hidrojen peroksit kullanarak Amplex substratını yaklaşık bire bir stokiyometriyle floresan bir ürün olan resorufine oksitler. Örnekteki peroksit, dedektörde floresansa dönüşür. Klasik ROS ailesindeki başka hiçbir tür bu reaksiyonu doğrudan yürütmez.

Belirleyici avantaj kalibrasyondur. Titiz bir araştırmacı, bilinen peroksit standartlarını aynı tamponda, aynı peroksidaz ve substrat konsantrasyonlarıyla, aynı inkübasyon süresi ve aynı optik ayarlarla analiz eder; ardından örnekleri bu eğriye göre değerlendirir. Bu yöntemin dayanağını oluşturan izole beyin mitokondrileri çalışmasında yazarlar tam olarak bunu yapmış, her ölçümün sonunda bilinen miktarlarda peroksit eklemiştir. Sayılar, keyfî floresans birimleri yerine dakikada miligram protein başına pikomol cinsinden hızlar olarak bildirilmiştir. Bir parıltıyı ölçüme dönüştüren budur.

Bu çalışmadaki üç ayrıntı örnek alınmaya değerdir. İlk olarak yazarlar, peroksiti parçalayan katalazla sinyali doğrulamıştır. Metilen mavisinin yol açtığı floresans artışı, katalaz eklendiğinde durmuş; böylece sinyalin optik bir artefakttan değil, peroksitten kaynaklandığı doğrulanmıştır. İkinci olarak, uyarma ışınını bir obtüratörle kesintiye uğratarak örneklerin normal ışık dozunun sekizde birini almasını sağlamış ve aydınlatmayı doğrudan test etmişlerdir; sinyal yalnızca yüzde dokuz azalmıştır. Bildirdikleri peroksitin yüzde doksanından fazlası ölçüm ışığından bağımsızdır. Üçüncü olarak, peroksitin giderilmesini bir elektrotla ayrıca ölçmüş ve boyanın hem üretimi artırdığını hem de giderilmeyi yavaşlattığını bulmuşlardır. Yalnızca net floresansı bildiren bir prob bu iki etkiyi birbirine karıştırırdı.

Analiz yine de hataya açıktır ve metilen mavisi bu zayıf noktaların birkaçını ortaya çıkarır. Boya, resorufinin emisyon yaptığı aynı kırmızı bölgede geniş bir aralıkta ışığı soğurur; bu nedenle yüksek boya konsantrasyonlarında örnek, iç filtre etkileriyle kendi sinyalini maskeleyebilir. Dolayısıyla standartlar, örneklerle aynı boya konsantrasyonunu içermelidir. Amplex Red kendi başına da fotooksitlenebilir; ürünü resorufin ise süperoksit ve peroksit üreten fotoredoks döngüsüne girebilir. Deneyde bir fotosensitizör de aydınlatılıyorsa bu büyük önem taşır. Pratik çözüm, boya ile probu birlikte aydınlatmak yerine önce metilen mavisi örneklerini ışığa maruz bırakmak ve ardından alikotları Amplex reaktifleriyle karanlıkta analiz etmektir. Son olarak, süperoksit dismutaz bir Amplex sinyalini yalnızca baskılamaz: süperoksiti peroksite dönüştürmesi sinyali artırabilir. Floresansı artıran bir SOD kontrolü başarısız değildir. Reaksiyonun önceki basamaklarında süperoksitin bulunduğunu belirlemiştir.

DCFDA: özgül olmayan bir oksidasyon göstergesi

Metilen mavisi ile DCFDA eşleşmesi, karışıklığın büyük bölümünün kaynağıdır. DCFH-DA, hücre içine yükleme için kullanılan bir öncüldür. Hücre içindeki esterazlar asetat gruplarını uzaklaştırarak floresan olmayan DCFH'yi bırakır; DCFH'nin oksidasyonu ise floresan DCF oluşturur. Onu oksitleyenlerin listesi uzundur: hidroksil radikalleri, peroksidaz ve hem ara ürünleri, azot dioksit, hipokloröz asit ve peroksinitrit türevi radikaller. Hidrojen peroksit tek başına onu pratik açıdan anlamlı herhangi bir hızda doğrudan oksitlemez; peroksite bağlı floresans genellikle süreçte demir, hem proteinleri veya peroksidaz kimyasının bulunmasını gerektirir.

Her yöntem bölümünde atıf yapılması gereken eleştiri, Kalyanaraman ve çalışma arkadaşlarının DCFH'nin prob olarak kullanımına ilişkin analizinden gelir. Bu nedenle DCFDA'yı reddeden beyin mitokondrileri çalışmasında özetlendiği üzere, bu araştırmacılar probun yavaş reaksiyona girdiğini, stokiyometrisinin tanımlanmadığını, geçerli kalibrasyonunun bulunmadığını ve ROS olmayan bileşiklerle de reaksiyona girdiğini göstermiştir. Prob ayrıca ölçtüğü şeyi çoğaltır: DCFH'nin tek elektronlu oksidasyonu, oksijenle reaksiyona girerek süperoksit oluşturan bir DCF radikali üretir; süperoksit de dismutasyona uğrayarak ek peroksit oluşturur. Ölçüm, bildirdiği kimyayı kısmen kendisi üretir.

Bunların hiçbiri DCFDA'yı yararsız kılmaz. Onu bir tanımlama yöntemi değil, bir tarama aracı yapar. DCF floresansındaki artış, oksidana bağlı prob oksidasyonunun arttığı anlamına gelir. Peroksitin arttığı anlamına gelmez; tek bir probun ölçemeyeceği bir nicelik olan toplam ROS'un arttığı anlamına ise kesinlikle gelmez. Bir mikromoların üzerindeki konsantrasyonlarda DCF oksidasyonuna dayanan önceki metilen mavisi çalışmaları prooksidan etkiler bildirmişken, aynı dönemde başka sistemler peroksitin yol açtığı hücre ölümüne karşı koruma bildirmiştir. Her iki gözlem de farklı redoks bağlamlarında aynı boya için doğru olabilir ve DCF sonucu tek başına sinyali hangi oksidanın oluşturduğunu söyleyemez. Önceki beyin mitokondrileri çalışmasının önemi, bu taramayı kalibre edilmiş bir peroksit ölçümüyle değiştirip peroksit yükünü doğrudan ortaya koymasıdır: yüz nanomolar boya bile test edilen her substratta ve solunum durumunda peroksit salımını birkaç kat artırmıştır.

DCFDA'nın metilen mavisine özgü bir tuzağı daha vardır. Boya yoğun renklidir ve redoks aktiftir; dolayısıyla floresansı soldurabilir, emisyonu söndürebilir veya hücresel ROS'tan bağımsız olarak probun kimyasal bileşenlerini oksitleyebilir. Boya ile prob içeren ancak hücre içermeyen bir kontrol, isteğe bağlı bir süs değildir. Boyanın probla etkileşip etkileşmediğini gösteren deneydir.

Spin yakalama ve oksijen tüketimi: türün kimliği ve akış

Floresan problar oksitlenebilir bir şeyin ortaya çıktığını bildirirken, spin tuzaklarıyla elektron spin rezonansı bunun ne olduğuna daha yakın bir yanıt verir. Klasik metilen mavisi fotokimyası çalışması, boya, askorbat ve ışıkla oluşan askorbat radikalini saptamak için ESR kullanmış, ardından oksijen tüketimi deneylerinde peroksit oluşumunu ve spin yakalama deneylerinde demirle katalizlenen hidroksil radikali oluşumunu göstermiştir. Her teknik, diğerlerinin yanıtlayamadığı soruyu yanıtlamıştır: ESR radikalin kimliğini, oksijen tüketimi herhangi bir floresan probdan bağımsız olarak reaksiyon akışını ortaya koymuş; bunların birleşimi ise aynı aydınlatılmış sistemde hem singlet oksijen hem de radikal yollarının işlediğini göstermiştir.

1984 tarihli bu sonuç hâlâ bir uyarı etiketi gibi okunur. Aydınlatma ve bir indirgeyici ajan varlığında boya peroksit üretmiş, demir varlığında ise sistem bu türler arasında en reaktif olan hidroksil radikalini oluşturmuştur. Yazarlar bunu gözdeki askorbatla ilişkilendirmiş ve gözde gelişigüzel kullanımını sorgulamıştır. Günümüz okurları koşullara dikkat etmelidir: ışık artı indirgeyici artı demir. Bunlardan herhangi biri çıkarıldığında yol zayıflar ya da ortadan kalkar.

Oksijen elektrotları değerini farklı bir yoldan kanıtlar. Clark tipi bir elektrot net oksijen tüketimini ölçer; bu, boyanın yönlendirdiği redoks kimyasının moleküler oksijen tükettiğini ortaya koyar ve hiçbir floresans artefaktının taklit edemeyeceği kinetik veriler sağlar. Ancak ürünü tanımlamaz. Peroksit, süperoksit ve su oluşumu ile singlet oksijenin bozunması oksijen tüketir. Türün kimliği bilinmeden akışın ölçülmesi, akış ölçülmeden türün kimliğinin belirlenmesi kadar eksiktir. Bu nedenle güçlü çalışmalar, elektrodu kalibre edilmiş bir peroksit analiziyle veya bir spin tuzağıyla birlikte kullanır.

Antioksidan sonuçlar neden çelişir?

Üç ölçümü yan yana koyduğunuzda, metilen mavisi literatüründeki görünür çelişkilerin yöntem farklılıkları ve üç biyolojik olgudan kaynaklandığı anlaşılır.

İlk olarak boya hem bir elektron taşıyıcısı hem de bir peroksit kaynağıdır. Elektronları, oksijenin aksi hâlde süperoksite dönüşeceği solunum bölgelerinden uzaklaştırarak bir ROS türünü azaltabilir; aynı zamanda indirgenmiş formu oksijeni doğrudan peroksite indirgeyerek başka bir türü artırabilir. Bu nedenle mitokondriyal redoks kimyasını ve boyanın alternatif elektron yolu sağlama rolünü araştıran bir laboratuvar, proba bağlı yanıtlar beklemelidir: aynı küvette süperoksite duyarlı bir ölçüm azalırken peroksit ölçümü artar.

İkinci olarak, düşük dozlarda peroksit yalnızca hasar kaynağı değil, bir sinyaldir. Önceki çalışmayı izleyen fare beyin mitokondrileri çalışması, elli nanomolar kadar düşük boya konsantrasyonlarında peroksit üretimi olduğunu, ancak terapötik düzeylerde mitokondriyal DNA lezyonları oluşmadığını ve ön uygulamanın rotenon kaynaklı lezyonlara karşı koruma sağladığını bulmuştur. Boya, yalnızca terapötik aralığın çok üzerindeki yüz mikromolar konsantrasyonda seçilmiş DNA parçalarına zarar vermiş; kırmızı ışık ile yirmi mikromolar boya ise test edilen tüm parçalara zarar veren singlet oksijen üretmiştir. Önerilen mekanizma hormetiktir: hafif peroksit üretimi, Nrf2 ile bağlantılı antioksidan savunmaları ve mitokondriyal biyogenezi tetikler; böylece kısa vadeli prooksidan ölçüm, daha uzun vadeli bir antioksidan sonuçtan önce gelir. Birinci saatte okunan bir analiz ile birinci günde okunan bir analiz farklı sonuçlar verebilir; çünkü arada biyoloji değişmiştir.

Üçüncü olarak ışık, ortamda hangi molekülün bulunduğunu bile belirler. Aydınlatma, boyayı demetile ederek Azure B ve ilişkili ürünlere dönüştürür; bir kabın üzerindeki mikroskop lambası bile onu fotosensitize etmeye yeterlidir. Karanlıkta ve aydınlatılmış ortamda yapılan deneyler farklı deneylerdir ve herhangi bir protokolün aydınlatma ve boyanın işlenmesine ilişkin kontroller bölümü bunları bu şekilde ele almalıdır.

Asgari kontrol seti ve herhangi bir iddianın nasıl okunacağı

Aşağıdaki karşılaştırma, bu makale için hazırlanmış özgün başvuru tablosudur. Herhangi bir metilen mavisi ROS sonucunu kabul etmeden önce, yazarların hangi satırı uyguladığını ve hangisini atladığını kontrol edin.

Bundan pratik bir okuma kuralı çıkar. Peroksidazla kullanılan, kalibre edilmiş ve katalaz kontrolü yapılmış Amplex, peroksit hakkında kanıt sağlar. DCFDA, özgül olmayan prob oksidasyonu hakkında kanıt sağlar ve bundan fazlasını söylemez. Radikal süpürücü kontrolleriyle yapılan spin yakalama, radikalin kimliği hakkında kanıt sağlar. Oksijen tüketimi ise akış hakkında kanıt sağlar. Analizinin destekleyebileceğinden fazlasını iddia eden bir cümle, ne kadar kendinden emin yazılmış olursa olsun, boya hakkında değil prob hakkında bir cümledir. Doz bağımlılığı ve hormetik aralık, mitokondriyal elektron akışı, boyalı örneklerde analiz interferansı ve mikroskop aydınlatma artefaktları hakkındaki ilgili tartışmalar bu noktaların her birini genişletir; yer tutucu referansları değiştirildiğinde de her biri geçerliliğini korur.