Metilen mavisi neden aside dirençli boyamada karşı boya olarak kullanılır

Bir teknisyen, tüm boyama aşamalarından sonra bir balgam yaymasını inceler. Mavi bir alan üzerinde kırmızı çomaklar belirginleşir ve rapora aside dirençli basillerin görüldüğü yazılır. Ertesi gün başka bir lamda kırmızı çomak içermeyen, tekdüze mavi bir alan görülür ve sonuç tüberküloz açısından negatif olarak raporlanır. Bu raporlardan biri, lamın desteklediğinden daha fazlasını iddia eder; bu da ilk rapor değildir.

Karışıklık kavramsaldır. Teknisyen mavi boyayı, sanki metilen mavisi mikobakterileri bulmaya yardımcı oluyormuş gibi, saptama kimyasının bir parçası olarak değerlendirmiştir. Oysa böyle bir işlevi yoktur. Metilen mavisi lama temas ettiğinde test zaten tamamlanmıştır. Boya yalnızca sonucun okunabilmesi için arka planı boyar. Bu makale, aside dirençli boyamada metilen mavisinin amacını, neden başka bir renk yerine mavi kullanıldığını ve mavi zemin üzerindeki kırmızıdan hangi sonuçları çıkarabileceğinizi açıklar.

Kısa yanıt

Aside dirençli boyama, üç fikre dayanan bir ayırıcı testtir. Birincil boya olan karbol fuksinin, mumsu mikobakteriler dahil her hücreye girmesi sağlanır. Renk giderici olan asit-alkol, sıradan hücrelerden kırmızı boyayı uzaklaştırır ancak aside dirençli hücrelerden çıkaramaz. Ardından karşı boya olan metilen mavisi, renk gidericinin boyasını uzaklaştırdığı her şeyi boyar; böylece aside dirençli olmayan hücreler, konak hücreleri ve artıklar mavi görünürken aside dirençli basiller kırmızı kalır. Karşı boya kontrast sağlar. Bir hücreyi aside dirençli kılan kimyada hiçbir rol oynamaz.

Her aşama ne yapar?

Aşağıdaki şema iş bölümünü gösterir. İşlem sırasını soldan sağa okuyun; alt şeridi ise her boyama grubunun farklı bir soruya yanıt aradığını hatırlatan bir bölüm olarak değerlendirin.

Önce penetrasyon gelir. Mikobakteriler, hücre zarfları alışılmadık derecede hidrofobik olduğu için sıradan sulu boyalara direnç gösterir; bu nedenle protokol boyanın içeri girişini zorlar. Ziehl-Neelsen yönteminde, buhar çıkana kadar ısıtma, fenol içeren karbol fuksini mumsu duvardan geçirir. Kinyoun soğuk yönteminde ısının yerini çok daha güçlü bir birincil boya formülasyonu alır; bazı değiştirilmiş ısıtmasız sürümlerde ise yüzey aktif maddeler eklenir. American Society for Microbiology'nin aside dirençli boyama protokolleri her iki formülasyonu yan yana belgeler ve konsantrasyon farkı dikkat çekicidir: ısıtmalı yöntemde 100 mL başına yaklaşık 0.3 g bazik fuksin, soğuk yöntemde ise yaklaşık 4 g kullanılır.

İkinci sırada ayrım gelir. Genellikle yüzde 95'lik 97 mL etanol içinde 3 mL konsantre hidroklorik asitten oluşan asit-alkol, duvarı özel bir direnç göstermeyen her hücreden kırmızı boyayı yıkayarak uzaklaştırır. Mikobakterilere özgü lipid zarfı sağlam olan hücreler boyayı tutar. Tüm yöntemin dayandığı aşama budur ve aşağıda ele alındığı gibi tekniğe en duyarlı aşama da budur.

Kontrast en son gelir. Lamda artık, boyası uzaklaştırılmış hücrelerden oluşan neredeyse renksiz bir arka plan üzerinde kırmızı, aside dirençli hücreler vardır. Yüzde 0.3 w/v metilen mavisi, kırmızıdan olabildiğince farklı bir renkle bu arka planı yeniden görünür kılar. Karşı boyama kısa sürer; ısıtmalı yöntemde genellikle 20 ila 30 saniye, bazı soğuk yöntem varyantlarında ise birkaç dakikaya kadar uygulanır. Süre, boyanın kendi özelliğinden ziyade protokole bağlıdır.

Neden bu boya, neden mavi?

Metilen mavisi katyonik bir bazik boyadır; yani renkli iyonu pozitif yük taşır ve rengi giderilmiş bakterilerin, konak hücrelerinin ve artıkların negatif yüklü yüzeylerine bağlanır. OpenStax Mikrobiyoloji, bu yük ilişkisini bazik boyaların ardındaki genel ilke olarak açıklar. Ancak metilen mavisi burada kimyasal açıdan benzersiz değildir. Kristal viyole ve safranin de bazik boyalardır. Seçim kimyasal değil, optiktir.

Kırmızı çomakların zıt bir tonda arka plana ihtiyacı vardır ve mavi, aydınlık alan mikroskopisi için kırmızıya en yararlı karşıtlığı sağlar. Safranin kötü bir karşı boya olurdu; çünkü oluşturduğu pembe-kırmızı renk, hücrede tutulan karbol fuksinin rengine fazla yakındır ve işlemin yarattığı ayrımı ortadan kaldırır. Kristal viyole ise ince kırmızı basillerle dikkat için yarışan koyu mor bir arka plan oluştururdu. İşlevin kimyadan ziyade kontrast olduğunu gösteren en güçlü kanıt, başka boyaların da kullanılabilmesidir: malahit yeşili ve parlak yeşil gibi yeşil karşı boyalar bazı veterinerlik protokollerinde ve değiştirilmiş protokollerde kullanılır. Belirgin biçimde farklı her renk tonu aynı işi gördüğünden test yine çalışır.

Buradan iki pratik sonuç çıkar. Birincisi, standart tarifte pH ayarlaması belirtilmez; bu sade, yüzde 0.3'lük sulu çözeltiyi, farklı bir boyama yaklaşımına ait olan Loeffler'in metilen mavisi gibi alkali formülasyonlarla karıştırmayın. İkincisi, aşırı uygulama zarar verir. Histoloji literatürü, çok yoğun mavi bir arka planın az sayıdaki basili gizleyebileceği konusunda özellikle uyarır. Bu nedenle lamı protokolün izin verdiğinden daha uzun süre boyayla kaplı tutmak, hiçbir yarar sağlamadan okunabilirliği azaltır.

Testi mümkün kılan duvar kimyası

Asit-alkolün ayrım yapabilmesinin nedeni mikobakteriyel zarfta yatar. Yapısal çekirdeği mikolil-arabinogalaktan-peptidoglikan kompleksidir: peptidoglikan, dış uçlarında çok uzun zincirli mikolik asitler taşıyan arabinogalaktana bağlıdır; bu yapı, geçirgenliği alışılmadık derecede düşük, lipid açısından zengin bir dış mikomembran oluşturur. Mikobakteriyel dış membrana ilişkin derleme bu mimariyi ayrıntılı olarak açıklar. Bariyer iki yönde de çalışır. Boyanın girişine direnç gösterir; bu yüzden penetrasyon için ısı veya güçlendirilmiş bir birincil boya gerekir. Boyanın çıkarılmasına da direnç gösterir; bu yüzden karbol fuksin içeri girdikten sonra asit-alkol onu uzaklaştıramaz. Sıradan bakterilerde bu zarf bulunmaz ve boya kaybolur. Dolayısıyla aside dirençlilik, fuksinin mikolik aside kimyasal olarak bağlanmasından ziyade bir lipid bariyeri olgusu olarak anlaşılmalıdır.

Bu kimya, sık karşılaşılan bir soruyu da açıklar: mikobakteriler Gram yöntemiyle zayıf ve öngörülemez biçimde boyanır; bazen soluk, boncuklu biçimler veya boyanmamış hayalet hücreler olarak görünürler. Hidrofobik duvarları kristal viyolenin penetrasyonunu sınırlar. Aside dirençli boyama, değiştirilmiş bir Gram boyaması değildir. Basit boyama ile Gram boyamasının karşılaştırmasında diğer iki yöntem için gösterildiği gibi, farklı bir duvar özelliğine dayanan farklı bir ayırıcı ilkedir.

Üç yöntem, üç soru

Tek boya kullanılan bakteriyel yöntemlerin daha geniş kapsamı için mikroskopi boyama atlasına bakın.

Mavi üzerindeki kırmızı neyi kanıtlayamaz?

Kırmızı çomaklar, organizmaların asit-alkol uygulaması boyunca karbol fuksini tuttuğu anlamına gelir. Bu bulgu Mycobacterium tuberculosis ile uyumludur; ancak CDC'nin tüberküloz tanı rehberi, diğer mikobakterilerin de aside dirençli olduğunu açıkça belirtir. Dolayısıyla tür tanımlaması renk değil, kültür ve nükleik asit testi gerektirir.

Teknik hatalar iki yıkama aşamasında yoğunlaşır. Yetersiz renk giderme, arka plan materyalini kırmızı bırakır ve yanlış pozitif yorumlara yol açabilir. Aşırı renk giderme, zayıf biçimde tutulan birincil boyayı uzaklaştırır ve yanlış negatif sonuçlara katkıda bulunur. Fazla yoğun uygulanan karşı boya, az sayıdaki basili mavi içinde gizler. Kalın yaymalar, çökelmiş reaktifler ve kontamine durulama suyu da kendi artefaktlarını ekler.

Teknik ne kadar düzgün olursa olsun, duyarlılık organizma yüküyle sınırlıdır. Geleneksel yayma mikroskopisi, mililitre balgam başına yaklaşık 5,000 ila 10,000 basil gerektirir. CDC'nin daha eski kanıt incelemeleri, kültürle doğrulanmış akciğer olgularında yayma duyarlılığını yaklaşık yüzde 45 ila 80 olarak bildirmiştir. Bu nedenle negatif bir yayma tüberkülozu asla dışlamaz. Güncel CDC rehberi, her yaymayla birlikte kültür yapılmasını öngörür ve akciğer tüberkülozu düşünüldüğünde, sonuç klinik yönetimi değiştirecekse en az bir solunum örneğinde nükleik asit amplifikasyon testi yapılmasını önerir.

Pratik uygulama yetkili protokollere dayanmalıdır

Bu makale dahil eğitim amaçlı açıklamalar, klinik çalışma yapma yetkisi vermez. Laboratuvar uygulamasında, güncel CDC, APHL veya CLSI belgeleriyle uyumlu, laboratuvarın valide edilmiş standart çalışma prosedürünü izleyin; CDC'nin Stacks arşivindeki aside dirençli boyama referansı, bu tür prosedürlerin reaktifleri ve sonuçların okunmasını nasıl tanımladığını gösterir. Tüberküloz örnekleriyle çalışma, biyolojik etkenin yayılmasını önleyen koruyucu koşullar gerektirir: hazırlık sırasında aerosol ve sıçramalar oluştuğundan yaymalar biyolojik güvenlik kabininde hazırlanır. CDC'nin laboratuvar güvenliği rehberi, ısıyla fikse edilmiş yaymaların bile canlı tüberküloz basilleri içerebileceğini ve yine de kontamine olarak ele alınması gerektiğini belirtir. CDC Halk Sağlığı Görsel Kütüphanesi'nde, M. leprae açısından incelenen karbol fuksin ve metilen mavisiyle boyanmış bir yaymaya ait kayıt, yöntemin tüberküloz dışındaki kapsamını hatırlatır: aside dirençli organizmaların arandığı her yerde mavi üzerindeki aynı kırmızı kontrast işe yarar ve dikkatle değerlendirilmiş negatif bir sonuç da kaydedilmeye değerdir.

Tamamlanmış lamın okunması

Karşı boyanın değeri tarama sırasında ortaya çıkar. Düşük büyütmede tarama yapan bir mikroskopist, önce mavi arka planı kullanarak yayma kalitesini değerlendirir: hücrelerin eşit dağılımı, odaklama için sağlam konak hücreleri ve yoğun çökelti bulunmaması. Ardından kırmızı adaylar, tam da lamdaki başka hiçbir şey kırmızı olmadığı için göze çarpar. Doğrulama yağ immersiyonu altında yapılır; burada gerçek basiller, tekdüze boya artıklarından farklı olarak beklenen ince, bazen hafif kıvrık veya boncuklu çomak görünümünü sergiler.

Arka plan boyaması, raporun ifade biçimini de belirler. Kırmızı basiller içeren bir lam, genellikle laboratuvarın ölçeğine göre yarı nicel bir dereceyle birlikte, aside dirençli basillerin görüldüğü şeklinde raporlanır. Kırmızı organizma görülmeyen bir lam ise aside dirençli basil görülmediği şeklinde raporlanır; asla tüberküloz açısından negatif olarak raporlanmaz. Bu ayrım önemlidir; çünkü mavi alan, boyamanın çalıştığını, hücrelerin karşı boyayı aldığını ve optik koşulların yeterli olduğunu gösterirken saptama sınırının altındaki organizmalar hakkında hiçbir şey söylemez. Kırmızı içermeyen mavi bir alan, lamla ilgili geçerli bir sonuçtur; hasta hakkında bir hüküm değildir.

İş bölümünü hatırladığınızda raporun nasıl yazılacağı kendiliğinden netleşir. Karbol fuksin adayları belirginleştirir. Asit-alkol testi gerçekleştirir. Metilen mavisi yalnızca yanıtı okunabilir kılar: kırmızı, aside rağmen boyayı tutmuştur; mavi ise boyayı kaybetmiştir. Tür, organizma yükü ve klinik anlam dahil diğer her şey, lamın ötesindeki çalışmalardan elde edilir.