Anaerobik koşul ve oksijen göstergesi olarak metilen mavisi: renk değişimi neyi kanıtlar?

Bir teknisyen anaerobik kavanozu kapatır, kapağın ardından metilen mavisi gösterge şeridini kontrol eder ve görmek istediği şeyi görür. Şerit maviden beyaza dönmüştür. İşlemi anaerobik olarak kaydeder ve işine devam eder. İki gün sonra bir plakta hiç üreme olmazken aynı kavanozun içindeki kapalı bir sıvı besiyeri tüpü oksijene maruz kalma belirtileri gösterir. Şerit doğruyu söylüyordu. Teknisyen ona yanlış soruyu sormuştu.

Buradaki karışıklık, kavramların birbirine karıştırılmasıdır. Metilen mavisi anaerobik göstergesi redoksla ilgili bir kavramdır; steriliteyle veya tüm sistemin doğrulanmasıyla ilgili değildir. Bu ayrım netleştiğinde şerit, dar kapsamlı bir görevi olan hassas ve dürüst bir araca dönüşür.

Kavram: tersinir bir redoks çifti

Çözünmüş metilen mavisi iki durumda bulunur. Oksitlenmiş biçimi, bildiğimiz mavi katyondur. Lökometilen mavisi adı verilen indirgenmiş biçimi ise renksizdir. Nötre yakın pH değerlerinde basitleştirilmiş yarı tepkimede bir mavi katyon, bir proton ve iki elektron birleşerek bir renksiz löko molekülü oluşturur. Formal potansiyeli, pH 7'de standart hidrojen elektroduna göre yaklaşık artı 11 milivolttur. Bu değer, onu birçok indirgeyici sistemin ulaşabildiği ve oksijenin tersine çevirebildiği bir aralığa yerleştirir.

İndirgenme, düşük bir yerel redoks potansiyeli gerektirir. Yalnızca oksijeni uzaklaştırmak bunu her zaman sağlamaz. Anaerobiyoz üzerine ilk çalışmalar, indirgeyici bir madde bulunmadıkça metilen mavisinin yalnızca oksijeni giderilmiş suda rengini koruduğunu göstermiştir. Ayrıca yaklaşık yüzde 0.01 boya içeren dekstrozlu sıvı besiyeri karışımlarının 37 C'de kolayca renksizleştiği, aynı karışımın 4 C'de tutulduğunda ise bir gün boyunca mavi kaldığı, taze doku ve anaerobik kültür koşulları üzerine deneylerde bildirilmiştir. Sıcaklık, pH, glikoz, askorbat, tiyoglikolat ve mikroorganizmaların indirgeyici etkinliği, elektronların kullanılabilir olup olmadığını birlikte belirler.

Yeniden oksitlenme için yalnızca oksijen gerekir. Hava löko biçimine ulaştığında bu biçim tekrar maviye döner. Modern tasarlanmış göstergeler tam olarak bu döngüden yararlanır: boya, indirgeyici ve stabilize edici bir matris; düşük oksijende renksiz, havaya maruz kaldığında yeniden mavi. Bu işleyiş, boya, indirgeyici, yüzey aktif madde ve kil temelli hibrit bir metilen mavisi oksijen göstergesinde gösterilmiştir. Bu prototipte pH 11'de 2.0 milimolar askorbat veya glikozla birlikte 0.01 milimolar boya kullanılmıştır. Gösterge, hacimce yaklaşık yüzde 0.5 oksijende renksizleşmiş ve test odasında yüzde 0.1'in altındaki oksijen düzeyini yüzde 0.5'in üzerindeki düzeyden ayırt etmiştir.

Dolayısıyla çalışma ilkesi basittir. Mavi, gösterge bölgesinin oksitlenmiş olduğu anlamına gelir. Renksiz, gösterge bölgesinde indirgeyici ve düşük oksijenli koşullara ulaşıldığı anlamına gelir. Değişim tersinir, yerel ve kimyasaldır. Tek başına mikroorganizmalar hakkında hiçbir şey söylemez.

Anaerobik kavanozda metilen mavisi gösterge şeridi nasıl çalışır?

Anaerobik kavanoz için kullanılan metilen mavisi gösterge şeridi, kap açılmadan görülebilecek şekilde kavanoz atmosferine yerleştirilen küçük bir tepkime bölgesidir. Ticari biçimler farklılık gösterir: kâğıt şeritler, kurulum sırasında çözülen veya ıslatılan tabletler ve daha yeni hibrit kâğıtlar. Bazıları tepkime bölgesini etkinleştirmek için bir damla distile su gerektirir. Diğerleri ise kuru kalması gereken kuru biçimli araçlardır. Suyun etkisi, yerleştirme ve okuma süresi kimyanın bir parçası olduğundan, kullanılacak ürüne ait talimatlar esas alınmalıdır.

Amaçlanan okuma, uygulamada iki durumdan oluşur. Mavi, şeritte oksijenin veya yeterince indirgeyici olmayan koşulların sürdüğü anlamına gelir. Beyaz ya da renksiz, şeritte anaerobik redoks koşullarının oluştuğu anlamına gelir. Bazı ticari kâğıtlara kırmızı bir arka plan pigmenti eklenir; bu nedenle indirgenmiş son durumları beyaz değil, pembe görünür. Değerlendirmeden önce ürününüzün hangi son durumu vaat ettiğini bilin.

Süre sisteme göre değişir. GasPak tarzı bir kurulumda rengin solması yaklaşık bir saat içinde başlamış ve birkaç saat içinde tamamlanmıştır; oda sıcaklığında yapılan kontrollü bir karşılaştırmada ise metilen mavisi için altı saatten fazla gerekmiştir. Bu çalışmada besiyerinin redoks potansiyeli, boyanın renk değişimi tamamlanmadan çok önce, 60 ila 100 dakika içinde yaklaşık eksi 100 milivolta ulaşmış; şerit tamamen renksizleştiğinde ise eksi 200 milivoltun oldukça altına inmiştir. Gösterge, atmosferdeki değişimi gecikmeli yansıtır. İlk saatte mavi olan bir şerit başarısızlığı kanıtlamaz; altıncı saatte beyaz olan bir şerit ise şeridin altıncı saatteki durumunu gösterir.

Aynı nedenle yerleştirme de önemlidir. Şeridi kavanozun tepe boşluğunda, kapaktan görülebilecek şekilde, agar yüzeylerinden ve kültür besiyerlerinden uzakta tutun. Şerit, hemen çevresindeki ortamı bildirir. Soğuk bir duvara düz biçimde yaslarsanız, plakların altına gömerseniz veya yoğuşma suyunun onu ıslatmasına izin verirseniz kavanozun değil, o mikroçevrenin durumunu bildirir.

Şerit neyi gösterir, neyi göstermez?

Anaerobik kavanozdaki metilen mavisi göstergesini, tek bir konumdaki tek bir sensör olarak düşünün. Kendi tepkime bölgesindeki yerel redoks ve oksijen koşullarını ortaya koyar; karışım ve dengeye ulaşma yeterliyse bu koşullar genel olarak tepe boşluğunu temsil eder. Bunun ötesindeki her şey bir çıkarımdır ve çıkarım için ayrı kanıt gerekir.

Renksiz bir şerit steriliteyi kanıtlamaz. Sterilite, canlı organizmaların bulunmamasıdır; valide edilmiş sterilizasyon ve kültür validasyon kontrolleriyle kanıtlanır. Bir kavanoz tamamen anaerobik olduğu hâlde kontamine olabilir veya tamamen steril olduğu hâlde aerobik olabilir.

Şerit, kültür sisteminin her bölümünü doğrulamaz. Kapalı bir tüpteki çözünmüş oksijen, agarın derinliklerinde hapsolmuş oksijen, fazla doldurulmuş bir kavanozdaki gradyanlar ve okumadan sonra oluşan bir sızıntı tek bir şeridin kapsamı dışındadır. Mekânsal deneyler, oksijenin nüfuz etmesi ile indirgeyici etkinliğin farklı dengelendiği aynı kapta yan yana mavi ve renksiz bölgeler bulunduğunu göstermiştir. Tek bir nokta, tüm hacmi doğrulayamaz.

Şerit, anaerobik koşulların kesintisiz sürdüğünü kanıtlamaz. Kurulum sırasında bir kez okunan şerit, yirminci saat hakkında hiçbir şey söylemez. Anaerobik kaliteye ilişkin yakın tarihli çalışmalar, kimyasal göstergelerin okundukları andaki atmosferi tanımladığını ve düşük düzeyde artık oksijen bulunmasına rağmen uygun görünebildiğini vurgular. Şeridin gösterdiği durum ile inkübasyon arasında bağlantı kuran şey, son duruma tek bir bakış değil; sürekli veya kontrol noktalarında yapılan kayıt tutmadır.

Renk değişiminin arkasındaki kimya için metilen mavisinin oksitlenmiş ve indirgenmiş durumlar arasında nasıl döngü oluşturduğuna bakın. Oksijenin numune işlemlerini daha geniş ölçekte nasıl şekillendirdiği için mikroskopi ve kültür çalışmalarında oksijen kontrolüne bakın.

Kavanozun yanında bulundurulacak bir şema

Aşağıdaki şekil, makaleyi laboratuvar tezgâhında kullanılabilecek tek bir başvuru görselinde özetler. Aynı şeridin üç durumu, tepkimenin iki yönü ve göstergenin sağladığı kanıt ile sistem validasyonu arasındaki sınır gösterilir.

Şeridi mavi bırakan veya yanlış güven veren sorunlar

Sorunların çoğu beş gruba ayrılır. Her birinin kendine özgü bir belirtisi vardır.

Sızdıran bir kavanoz veya poşet, tepkime bölgesine sürekli oksijen sağlar. Şerit mavi kalır veya rengi solduktan sonra yeniden mavileşir. Kimyayı suçlamadan önce kapağı, contayı, kelepçeleri ve sızdırmazlık yüzeylerini kontrol edin.

Tükenmiş veya hatalı etkinleştirilmiş bir gaz üretici, oksijeni hiç uzaklaştırmaz. Eski suyla etkinleştirilen sistemlerde, yaklaşık 10 ila 15 dakika içinde yoğuşma görülmemesi ve yaklaşık 20 ila 40 dakika içinde kapağın ısınmaması o sistem için erken uyarılardı. Fazla yüklenmiş bir kavanozda kapasitesi yetersiz bir saşe de aynı şekilde başarısız olur.

Katalizör zehirlenmesi yalnızca eski hidrojen ve paladyum sistemleri için geçerlidir; bu sistemlerde paladyum, hidrojen ile oksijenin birleşerek su oluşturmasını sağlar. Nem ve hidrojen sülfür katalizörü bozar. Güncel saşelerin çoğu hiç paladyum kullanmaz; dolayısıyla bu çözümü ilgili olmayan sistemlerde uygulamayın.

Bozulmuş veya yanlış kullanılmış bir şerit, belirgin bir uyarı vermeden işlevini yitirir. Boya ve indirgeyici, depolama sırasında tersinirliklerini kaybeder. Hibrit formülasyonların ışığa bağlı solmaya ve depolama sırasındaki kayıplara dirençli olacak şekilde geliştirilmesinin nedenlerinden biri budur. Son kullanma tarihi geçmiş malzemeleri, başlangıç rengi anormal olan malzemeleri ve kuru kalması gerekirken ıslatılan ya da ıslatılması gerekirken kuru bırakılan şeritleri kullanmayın.

Bir gradyan veya gecikme, kimyayı değil okuyucuyu yanıltır. Yetersiz karışmış tepe boşluğu, çözünmüş oksijen içeren kapalı tüpler ve yarı katı besiyerleri, kendi koşullarını şeridin düşündürdüğünden daha uzun süre korur. Resazurin şeritleri pembeden geçerek renksizleşir ve genellikle daha hızlı oldukları belirtilerek pazarlanır; ancak eşikleri kendi formülasyonlarına özgüdür ve metilen mavisine uygulanamaz.

Kontroller ve örnek alınabilecek bir okuma protokolü

İki düşük maliyetli kontrol, yanlış okumaların çoğunu yakalar. İşlemle birlikte oda havasında yeni bir hava kontrol şeridi bulundurun. İşlevini yerine getiren bir metilen mavisi şeridi burada mavi kalır. Bazı ambalajlı göstergeler başlangıçta soluk renklidir ve açıldıklarında mavileşir; bu da başlı başına bir işlev kontrolüdür. Ayrıca düzenli aralıklarla, daha önce valide edilmiş bir anaerobik düzeneğe yeni bir şerit yerleştirin. Şerit, ürün için belirtilen süre içinde valide edilmiş indirgenmiş son duruma ulaşmalıdır. Kontrollerden biri beklenen şekilde davranmazsa kavanoz okumalarına güvenmeden önce o partiyi değiştirin.

Okuma protokolü, mekanizmanın doğal sonucudur. Şeridi, kavanoz açılmadan tepe boşluğunda görülebilecek bir yere yerleştirin; duvarla temas ve ıslatma konusunda ürün talimatlarına uyun. Başlangıç rengini, kavanozun kapatıldığı zamanı ve ürün için belirtilen kontrol noktasındaki rengi kaydedin. Kabın yapısı izin veriyorsa, inkübasyon sırasında belirlenmiş kontrol noktalarında göstergenin indirgenmiş durumda kaldığını kaydedin. Açmadan hemen önce son rengi kaydedin. Açmadan önceki bu renk, o işlemin son durumudur. Açtıktan sonra yeniden mavileşme bekleyin ve bunun önceki kaydı değiştirmesine izin vermeyin.

Şerit, belirtilen sürenin ötesinde mavi kalırsa anaerobiyozu doğrulanmamış kabul edin. Kontrol zincirini sırayla izleyin: sızdırmazlık, saşe, varsa katalizör, göstergenin ıslatılma durumu ve son kullanma tarihi, ardından hava kontrolüyle karşılaştırarak göstergenin işlevi. Üreme veya üreme olmaması, ancak atmosfer doğrulandıktan sonra, uygulamaya uygun anaerobik kültür düzeneği ve organizma kontrolleri kullanılarak yorumlanmalıdır.

Şerit, kendi alanında son sözü söylemeyi hak eder. Mavi ya da renksiz olsun, tek bir yerde ve tek bir anda tek bir soruyu yanıtlar. O soruyu, yanında kontrollerle ve belirlenen zamanlarda sorun; güvenilir biçimde yanıt verir. Ona steriliteyi, her bir tüpü veya tek bir bakıştan tüm inkübasyonu sorarsanız hiçbir gösterge kimyası bu okumayı kurtaramaz.