Loeffler'in alkali ve polikrom metilen mavisi boyalarının açıklaması

Bir boyama tezgâhında, her birinin etiketinde metilen mavisinin farklı bir çeşidi yazan üç şişe yan yana durabilir. Birinde sulu metilen mavisi 1% yazar. Birinde Loeffler'in alkali metilen mavisi. Birinde polikrom metilen mavisi. İşleri yoğun olan bir çalışan, en yakındaki şişeye uzanır. Ardından yayma ya çok soluk, ya fazla tekdüze mavi ya da beklenmedik mor tonlarında boyanır ve sonuçtan numune sorumlu tutulur.

Bu, numuneden değil formülasyondan kaynaklanan bir sorundur. Üç çözelti birbiriyle ilişkili boyalar içerir, ancak farklı boyama yaklaşımlarını temsil eder. Biri, nötre yakın pH'ta sade bir katyonik boyadır. Biri, alkali eklenerek etkisi artırılmış aynı boyadır. Diğeri ise artık tek bir boya değil, bilinçli olarak oksitlenmiş bir karışımdır. Yanlış olanı kullandığınızda boyama ilkesi elinizin altında değişir.

Kısa yanıt

Sade sulu metilen mavisi temel referanstır: suda yaklaşık 1% boya içeren, bakteri morfolojisi ve genel mikroskopi için kullanılan basit bir katyonik boyadır. Loeffler'in alkali metilen mavisinde, suyla seyreltilmiş alkollü stok çözeltiye az miktarda, ölçülmüş seyreltik alkali eklenir; bu, pH'ı yükseltir ve katyonik boyanın asidik bakteri yapılarına daha güçlü bağlanmasını sağlar. Polikrom metilen mavisi ise alkali ortamda oksidasyon yoluyla bilinçli olarak olgunlaştırılmış metilen mavisidir. Bu nedenle şişede, kalan metilen mavisinin yanı sıra demetillenmiş homologlar (azure A, azure B, azure C), tiyonin ve metilen morundan oluşan bir karışım bulunur; bu karışım farklı yapıları farklı renk tonlarında boyar.

Yalnızca tek bir cümleyi hatırlayacaksanız: alkalileştirme boyama yoğunluğunu, polikromlaştırma ise boyama renklerini değiştirir.

Sıradan sulu metilen mavisi: referans noktası

En basit formülasyon, alkali eklenmeden ve oksidasyon uygulanmadan, genellikle 1% w/v derişiminde suda çözünmüş metilen mavisidir. Renkli tür, klorür karşı iyonuna sahip metiltiyoninyum katyonudur; PubChem'in metilen mavisi kaydında metiltiyoninyum klorür olarak tanımlanan, küçük ve düzlemsel bir fenotiyazin boyasıdır. Katyon olarak nükleik asitlerin fosfat omurgalarına ve bakteri hücre duvarlarındaki asidik gruplara bağlanır; hücreleri açık bir arka plan üzerinde maviye boyar.

Avantajı, öngörülebilir olmasıdır. Çekirdekler ve bakteriler mavi görünür. Kontrast sınırlıdır. Soluk görünen mikroorganizmalar zayıf boyanabilir; Loeffler'in gidermeyi amaçladığı sınırlama tam olarak budur. Bu çözeltinin ait olduğu daha geniş basit bakteri boyaları ailesi için bakterilerin basit boyanmasına ilişkin bir genel bakışa bakın. Burada da boya kimliğinin titizlikle doğrulanması önemlidir: metil mavisi ile metilen mavisi karşılaştırmasında açıklandığı gibi, metil mavisi tamamen farklı bir moleküldür; dolayısıyla katalogda yalnızca renk adına göre arama yapmak yanlış boya sınıfına yönlendirebilir.

Loeffler'in alkali metilen mavisi: aynı boyanın daha güçlü kullanımı

Klasik Loeffler reçetesi, alkollü bir metilen mavisi stok çözeltisini suda seyreltik alkaliyle birleştirir. Ders kitaplarındaki tariflerde, 30 mL 95% etanol içinde 0.3 g boya ile 100 mL 0.01% sulu potasyum hidroksit kullanılır (ya da eşdeğer olarak 30 mL doygun alkollü metilen mavisi, 100 mL damıtılmış su ve 1 mL 1% KOH). Böylece belirgin biçimde alkali pH'ta, yaklaşık 0.3% boya içeren bir çalışma çözeltisi elde edilir. Ticari ürünler de aynı ilkeyi izler; Thermo Fisher mikrobiyoloji boyaları kataloğu, Loeffler'in alkali metilen mavisini polikrom ve sulu çeşitlerle birlikte, farklı kullanım amaçlarına sahip ayrı katalog ürünleri olarak listeler.

Buradaki belirleyici unsur alkalidir. pH'ın yükseltilmesi, numunedeki karboksil ve fosfat gruplarının protonlarını kaybetmesine yol açarak negatif yüklü bağlanma bölgelerinin yoğunluğunu artırır. Alkollü stok çözelti ise boyanın tamamen çözünmüş halde kalmasını sağlar; böylece boya bu bölgelere monomerik biçimde ulaşır. Sonuç, nötr sulu boyaya kıyasla bakterilerin daha hızlı ve daha yoğun boyanmasıdır; rutin bir bakteriyolojik yaymada tanıdık koyu mavi çomaklar ve koklar görülür. Boyama süresi genellikle bir ila üç dakikadır; ardından suyla durulanır.

Klasik uygulama, Loeffler serum besiyerinde üretilmiş Corynebacterium diphtheriae'dir: depolanmış polifosfattan oluşan, güçlü biçimde boyanmış metakromatik Babes-Ernst granüllerine sahip, ince ve çoğu zaman topuz biçimli çomaklar. Besiyeri ile boyanın bu eşleşmesi tarihseldir; her ikisi de aynı bakteriyoloğa atfedilir ve tanısal kazanım, granüllerin sağladığı kontrasttır. Difteri çalışmalarının ötesinde bu boya, kültürlerden hazırlanan yaymalarda genel bakteriyolojik boya olarak, klinik yaymalarda Neisseria morfolojisini göstermek için ve Gram boyamanın gereksiz olduğu ancak sade sulu mavinin fazla soluk kaldığı durumlarda kullanılır. Tek renkli bir boyadır. Asidik olan her şey mavinin bir tonunu alır. Bir protokol renklerle ayrım yapılmasını gerektiriyorsa alkali tek başına bunu sağlayamaz.

Pratik bir uyarı: alkali boya çözeltileri, depolama ve karbondioksit alımı nedeniyle bozulur ve çökelti oluşturur. Laboratuvarlar, artık her lamın üzerine tortu bırakan eski bir şişeyi kullanmaya devam etmek yerine ya küçük hacimlerde çözelti hazırlar ya da katalog ürününü satın alıp raf ömrüne uyar.

Polikrom metilen mavisi: tek ad, birden fazla boya

Polikrom metilen mavisi aynı boyayla başlar, ancak onu alkali ortamda kontrollü oksidasyona tabi tutar; bu işlem tarihsel olarak olgunlaştırma veya polikromlaştırma olarak adlandırılır. Alkali ortamda bekletme, karbonatla ısıtma ya da dikromat gibi maddelerle oksidasyon, dimetilamino sübstitüentlerinden metil gruplarını aşamalı olarak uzaklaştırır. Ürün bir karışımdır: kalan metilen mavisi ile azure B (bir metil grubu kaybolmuş), azure A ve azure C (daha ileri demetilasyon), tiyonin (tamamen demetillenmiş) ve metilen moru ailesinin oksidatif yan ürünleri. Her bileşenin kendine özgü bir renk tonu ve doku afinitesi vardır; bu nedenle karışım metakromatik boyama yapar: çekirdekler, granüller, müsinler ve kıkırdak, maviden kırmızı-mora uzanan farklı tonlar alır.

Bu kimya, ünlü kan boyalarının temelindeki kimyayla aynıdır. İlk araştırmacılar, alkalileştirilmiş metilen mavisinin sıtma parazitlerinin çekirdeklerini mor tonlarında boyadığını bulmuştu; ancak olgunlaştırılmış sulu çözeltileri kararsızdı ve birkaç gün içinde çökeliyordu. Mor kan boyasının nasıl icat edildiğini ele alan derleme; Malachowski ve Romanowsky'nin 1891'de birbirlerinden bağımsız olarak bu etkiden nasıl yararlandığını, boya çökeltisini kararlı hale getirmek ve yaymaları ısı kullanmadan fikse etmek için metanolün nasıl kullanılmaya başlandığını ve Giemsa'nın daha sonra karışımı ölçülmüş azure B ile eozin temelinde, gliserolle stabilizasyon sağlayarak nasıl standartlaştırdığını anlatır. Modern Giemsa tipi boyalar, Romanowsky etkisini oluşturan polikrom metilen mavisi ile eozin birleşiminden doğrudan türemiştir. Eozinle eşleştirme ve azure B bileşeni hakkında ayrıntılar için Romanowsky tipi boyalar ve azure B-eozin etkileşimine bakın.

Bir karışım olduğu için polikrom metilen mavisi, doğası gereği bu üçü arasında en az standartlaştırılmış olandır. Renk tonlarının kesin dengesi, oksidasyon yöntemine ve derecesine bağlıdır. Bu yüzden histoloji tedarikçileri onu bekletilmiş Loeffler çözeltisi olarak değil, kendi performans testleri olan ayrı bir ürün olarak satar. Tipik kullanım alanları arasında mast hücresi granüllerinin, müsinlerin ve kıkırdağın metakromatik olarak gösterilmesi, plazma hücrelerinin ayrıntıları ve Goodpasture tipi polikrom yöntemlerle doku kesitlerinde Helicobacter pylori'nin gösterilmesi bulunur. Amaç renk yoluyla ayrım yapmak olduğunda doğru seçimdir; protokol net, tek renkli bir bakteri silueti beklediğinde ise yanlış seçimdir.

Formülasyon ve kullanım amacı karşılaştırması

Tabloyu bir karar verme yöntemi olarak okuyun. Numune çok soluk boyanıyorsa pH yaklaşımını değiştirin ve Loeffler'i seçin. Her şey boyanıyor ama hiçbir yapı diğerinden ayırt edilemiyorsa boya yaklaşımını değiştirin ve polikromu seçin. Bir Loeffler yayması granülleri çok güzel gösteriyor ama sorumlu kişi çekirdeklerin ve sitoplazmanın neden aynı maviye boyandığını soruyorsa yanıt, hiçbir alkali tek renkli boyanın bu ayrımı yapamayacağıdır. Bu soru, polikrom ailesinin ve onun kan boyası türevlerinin alanına girer.

Yaygın karışıklıklardan kaçınmak

Karışıklığın büyük bölümünü iki hata açıklar. İlki, her ikisi de şişede mavi göründüğü için Loeffler çözeltisini sade metilen mavisiyle birbirinin yerine kullanılabilir saymaktır. pH ve boyama yoğunluğu bakımından farklıdırlar; Loeffler'in belirtildiği yerde nötr boya kullanılması, protokolün özellikle elde etmek üzere tasarlandığı granül kontrastını ortadan kaldırır. İkincisi, herhangi bir eski veya kazara beklemiş alkali maviyi polikrom olarak kabul etmektir. Kontrolsüz bekletme, bilinmeyen derişimde ve içeriği bilinmeyen bir karışım oluşturur. Gerçek polikrom çözeltiler ise tanımlanmış oksidasyon yöntemleriyle hazırlanır ve kan boyaları soyunda ölçülmüş eozinle birleştirilir. Tarih burada öğreticidir: 1890'ların kararsız, olgunlaştırılmış sulu çözeltileri, tam da kontrolsüz karışımlar tekrarlanabilir biçimde üretilemediği için yerini metanolle kararlı hale getirilmiş formülasyonlara bırakmıştır. Bu, ne kadar eski olduğu belirsiz bir şişeden alınan boyayla tanısal bir lamı boyamadan önce hatırlanmaya değer bir derstir.

Adlandırmada titizlik bu süreci tamamlar. Renkten çıkarım yapmak yerine katalog ürününü (sulu, Loeffler veya polikrom), boya içeriğini ve amaçlanan uygulamayı etiketten doğrulayın. Üç formülasyonun ortak bir kromofor kökeni vardır. Kullanım amaçları ise aynı değildir.