Bakit nagbabago ang absorpsyon ng methylene blue ayon sa konsentrasyon

Kumuha ng isang bote ng stock solution ng methylene blue at magsalin sa dalawang baso. Punuin ang una mula sa stock solution at ang ikalawa mula sa solusyong pinalabnaw nang sampung ulit. Mas maputla ang ikalawang baso, gaya ng inaasahan. Tingnang mabuti at may isa pang nagbago. Nag-iba ang tono ng kulay. Ang isang solusyon ay mas kahawig ng malinaw na asul ng langit, habang ang isa ay asul na may bahid na lila. Hindi lang pinahina ng pagpapalabnaw ang tindi ng kulay. Binago nito kung aling kemikal na species ang sumisipsip ng karamihan sa liwanag.

Simple ang konsepto sa likod ng pagbabagong ito. Hindi iisang species ang natunaw na methylene blue. Ang nag-iisang kation ng pangkulay, na tinatawag na monomer, ay maaaring magpatong nang magkaharap sa isa pang kation upang bumuo ng dimer, at maaaring lumaki ang mga dimer tungo sa mas malalaking agregat. May sariling absorption spectrum ang bawat anyo. Ang iniuulat ng spectrophotometer ay ang kabuuang ambag ng lahat ng nasa halo sa cuvette na iyon, sa mga kondisyong iyon. Baguhin ang halo at magbabago ang spectrum, kahit na sumusunod ang kabuuang dami ng pangkulay sa tuwid na proporsiyon ng pagpapalabnaw.

Magkaiba ang pagsipsip ng liwanag ng monomer at dimer

Isipin ang monomer bilang isang patag na kard na may positibong kargang nakakalat sa sistema ng mga singsing nito. Maaaring magpatong nang magkaharap ang dalawang ganitong kard. Nagtutulakan ang mga positibong karga, ngunit nag-aakit ang patag na mga aromatikong ibabaw sa pamamagitan ng mga interaksiyon ng pagpapatong, at pinahihina ng nakapaligid na tubig at mga counterion ang pagtutulakan. Ang resulta ay isang magkabigkis na pares na may pinagsasaluhang mga elektronikong estado. Mas mataas ang enerhiya ng mga pinapayagang transisyon nito kaysa sa transisyon ng monomer, kaya lumilitaw ang banda ng dimer sa mas maikling wavelength kaysa sa banda ng monomer, habang ang mas malalaking agregat ay nagbibigay ng karagdagang ambag sa panig ng asul bilang isang balikat ng banda.

Sa napakababang konsentrasyon sa malinis na tubig, nangingibabaw ang mga monomer at ang banda sa mahabang wavelength. Habang tumataas ang kabuuang konsentrasyon, lumalaki ang bahagi ng anyong magkapares at lumalakas ang banda sa mas maikling wavelength kaugnay ng una. Samakatuwid, ipinapakita ng ratio ng dalawang banda ang komposisyon ng halo, hindi ang kabuuang konsentrasyon nang direkta. Hindi mapaghihiwalay ng pagsukat sa iisang wavelength ang dalawa nang walang palagay tungkol sa kung aling anyo ang naroon.

Ito ang dahilan kung bakit dapat laging kasama ng mga reperensiyang spectrum ang mga kondisyon. Itinatala sa reperensiyang spektral para sa methylene blue ang mga posisyon ng banda kasama ang solvent, nilalamang asin, pH, temperatura, at saklaw ng konsentrasyong pinagmulan ng mga ito. Kung magbabanggit ng tuktok nang wala ang mga kondisyong iyon, kulang ang paglalarawan sa bilang. Maaaring parehong tama ang dalawang laboratoryo tungkol sa magkaibang spectrum ng iisang pangkulay dahil magkaibang halo ang sinukat nila.

Ano ang nagpapabago sa ekwilibriyo

Konsentrasyon ang pangunahing salik. Kailangang magtagpo ang dalawang monomer upang mabuo ang dimer, kaya mas mabilis kaysa sa linear na pagtaas ang paglaki ng bahagi nito kasabay ng kabuuang pangkulay. Nasa libo-libo bawat molar ang mga naiulat na konstante ng dimerisasyon sa tubig malapit sa temperatura ng silid, kaya mabilis na tumataas ang bahagi ng dimer sa saklaw na micromolar. Sa isang malawakang pag-aangkop ng modelo sa datos mula micromolar hanggang millimolar na pangkulay, may ambag na ang tetramer kahit mas mababa sa 34 micromolar. Babala ito laban sa lubos na pagtitiwala sa modelong mahigpit na limitado sa dalawang species sa konsentrasyong sampu-sampung micromolar. Nakadepende sa medium ang eksaktong mga bahagi, kaya mga direksiyon ng pagbabago ang ibinibigay ng artikulong ito sa halip na isang unibersal na talahanayan ng conversion.

Asin ang ikalawang salik. Pinahihina ng mga natunaw na ion ang pagtutulakan sa pagitan ng dalawang kation, kaya itinutulak ng idinagdag na sodium chloride at mga katulad na electrolyte ang halo patungo sa mga dimer at agregat sa parehong konsentrasyon ng pangkulay. Makikita ang epektong ito sa mga pag-aaral ng agregasyon ng methylene blue sa mga medium na may asin at tubig, kung saan sinukat ang pangkulay mula humigit-kumulang 1 micromolar hanggang 3.4 millimolar sa 0 hanggang 0.15 molar na sodium chloride. Sa pag-aangkop na iyon, umabot sa humigit-kumulang 0.93 ang bahagi ng tetramer sa kondisyong kapwa mataas ang pangkulay at asin. Samakatuwid, hindi mapagpapalit na pamantayan ang spectrum na naitala sa tubig at ang naitala sa physiological saline.

Kabaligtaran ang direksiyon ng epekto ng temperatura. Nagpapakawala ng nakabigkis na tubig ang pagpapatong at sinasalungat ito ng paggalaw dulot ng init, kaya karaniwang naghihiwalay ang ilang dimer pabalik sa mga monomer kapag pinainit ang solusyon, samantalang pinapaboran ng pagpapalamig ang pagsasama. Negatibo ang entalpiya ng paghihiwalay na nakuha sa pag-aangkop, humigit-kumulang minus 30 kilojoules per mole sa 282 hanggang 333 kelvin, na nagpapatunay na eksotermiko ang pagsasama. Maaaring magmukhang mas maraming agregat ang malamig na sample na sinukat kaagad matapos ilabas sa refrigerator kaysa sa parehong sample na sinukat matapos umabot sa ekwilibriyo sa temperatura ng silid.

Itinatakda ng solvent ang panimulang kalagayan. Dahil sa malakas na hydrophobic effect nito, hinihikayat ng tubig ang pagpapatong ng mga patag na kation ng pangkulay. Mas mahusay na nababalutan ng mga molekula ng alcohol, gaya ng ethanol at methanol, ang mga singsing at napaghihiwalay ang mga agregat, kaya sa parehong konsentrasyon ng pangkulay ay mas nangingibabaw ang monomer sa ethanol kaysa sa tubig. Ganoon din ang ginagawa ng mga aprotic na cosolvent: sa mga halo ng tubig at DMSO sa 293 kelvin, pinigilan ng idinagdag na DMSO ang dimerisasyon, na nagpapahiwatig na ang estruktura ng tubig ay nagtutulak sa pagpapatong. Kailangang mag-ingat sa mga surfactant sa parehong direksiyon. Kapag lampas sa kanilang kritikal na konsentrasyon ng micelle, maaaring mapanatiling natunaw ng mga micelle ang mga monomer nang paisa-isa at maibalik ang spectrum na kahawig ng monomer. Kapag mas mababa sa puntong iyon, maaaring itaguyod naman ng surfactant na may kasalungat na karga ang pagpapatong: sa 100 micromolar na pangkulay, umabot sa tugatog ang polimerisasyong dulot ng SDS malapit sa 4 millimolar na SDS, humigit-kumulang kalahati ng konsentrasyong kailangan para mabuo ang mga micelle, bago nagkaroon ng muling pamamahagi sa mas mataas na antas ng surfactant. Ipinapakita ng pag-aaral tungkol sa mga epekto ng solvent at organisadong medium sa spectrum ng methylene blue kung gaano kalakas itakda ng agarang kapaligiran ng mga molekula, hindi lang ng kabuuang konsentrasyon, ang mga naobserbahang banda.

Pangunahing mahalaga ang pH sa mga sukdulang antas nito. Sa halos neutral na saklaw na ginagamit sa karamihan ng gawain sa laboratoryo, nananatili ang methylene blue sa karaniwang asul na anyong kationiko nito, at agregasyon ang nangingibabaw sa mga pagbabagong spektral. Ang matapang na asido o base, mga reaksiyong redox na lumilikha ng walang-kulay na anyong leuco, o pagbigkis sa mga protina at partikulo ay pawang nagdaragdag ng mga estadong lampas sa pares ng monomer at dimer. Kapag nagbago ang spectrum matapos magdagdag ng buffer, suriin muna ang komposisyon ng buffer para sa asin at mga sangkap na maaaring magbigkis bago iugnay ang lahat sa pH lamang. Hinihiwalay ng reperensiya tungkol sa kimika at protonasyon ang mga tanong na ito tungkol sa pagkakakilanlan mula sa usapin ng agregasyong tinatalakay rito.

Bakit kumukurba ang tuwid na linya ng Beer-Lambert

Ayon sa ugnayang Beer-Lambert, ang absorbance ay katumbas ng absorptivity na minultiplika sa konsentrasyon at sa haba ng landas ng liwanag. Isa itong batas ng pagbibilang. Ipinapalagay nitong nananatiling magkakapareho ang mga bagay na binibilang habang nagbabago ang dami nila: iisang species na sumisipsip ng liwanag, hindi nagbabagong spectrum, walang reaksiyong kemikal kasabay ng pagbabago ng konsentrasyon, iisang wavelength ng liwanag na panukat, walang pagkalat o muling paglabas ng liwanag, at liwanag na talagang dumaraan sa nakasaad na landas.

Nilalabag ng agregasyon ang unang palagay. Sa pormal na paglalarawan, nananatiling kabuuan ng mga ambag ng bawat species ang absorbance: haba ng landas na minultiplika sa absorptivity ng bawat species at sa sarili nitong konsentrasyon. Sumusunod ang bawat species sa batas. Hindi ang halo, dahil hindi linear ang ugnayan ng mga konsentrasyon ng species sa kabuuang pangkulay. Kaya ang kurba ng kalibrasyon ng absorbance sa banda ng monomer laban sa kabuuang pangkulay ay nagsisimulang tuwid sa napakalabnaw na kondisyon at kumukurba pababa habang tumataas ang konsentrasyon, dahil proporsiyonal na mas kaunting monomer ang dala ng bawat karagdagang dami. Kabaligtaran ang pagkakurba ng kurbang binabasa sa banda ng dimer. Tinutukoy ng mga pag-aaral sa agregasyon ang mismong mekanismong ito bilang pinagmumulan ng mga naobserbahang paglihis sa Lambert-Beer. Ang karaniwang pagkakamali ay ang pag-aangkop ng tuwid na linya sa kurbadong bahagi at pag-ekstrapola nito. Balido lamang ang linya sa loob ng saklaw at matrix kung saan ito ginawa.

Lumilikha ang pagpapalabnaw ng kaugnay na bitag. Hindi napapanatili ang ratio ng mga species kapag pinalabnaw ang isang konsentradong stock solution upang umabot sa saklaw ng instrumento. Muling umaabot sa ekwilibriyo ang pinalabnaw na laman ng cuvette na mas pabor sa monomer, kaya tama nitong inilalarawan ang pinalabnaw na sample ngunit mali ang paglalarawan nito sa stock solution. Ang muling pagkalkula ng spectrum ng stock solution sa pamamagitan ng pagpapataas nang proporsiyonal sa mga absorbance ay nakapagbabalik lamang ng pagtataya ng kabuuang nilalaman kung isinasaalang-alang na ng kalibrasyon ang pagbabago. Hindi nito kailanman naibabalik ang orihinal na hugis ng banda. Sinumang naghahambing ng spectrum ng konsentradong solusyon sa isang malabnaw na reperensiya ay naghahambing ng dalawang magkaibang halo.

Bahagi ng resulta ang haba ng landas ng liwanag

Proporsiyonal ang absorbance sa distansiyang dinaraanan ng liwanag sa sample. Ang 10 mm na cuvette ay nagbibigay ng sampung ulit na absorbance ng 1 mm na cuvette na may parehong solusyon. Eksakto lamang ang proporsiyong iyon para sa parehong solusyon, at ginagawang napakahalaga ng agregasyon ang kondisyong iyon.

Sa praktika, kasangkapan ang haba ng landas upang manatili sa loob ng balidong saklaw. Nagbibigay ng sensitibong pagsukat ang mahabang landas para sa malalabnaw na solusyong karamihan ay monomer. Pinananatili ng maikling landas ang konsentradong sample sa saklaw ng instrumento nang hindi nangangailangan ng malaking pagpapalabnaw na muling magtatakda ng ekwilibriyo. Ito mismo ang ginawa ng programang pag-aaral sa agregasyong pinagmulan ng mga bilang sa itaas: mga cell na 1 centimeter para sa 1.1 hanggang 34 micromolar na pangkulay, at mga cell na 0.01 centimeter para sa 94 micromolar hanggang 3.4 millimolar. May sarili ring heometriya ang mga pedestal para sa napakaliit na bolyum at mga plate reader, na may maiikli at kung minsan ay nagbabagong landas, pati mga ibabaw kung saan maaaring dumikit sa pamamagitan ng adsorption ang kationikong pangkulay. Iulat ang haba ng landas kasama ng bilang, gaya ng pag-uulat ng reperensiyang spektral sa solvent at asin. Hindi isang resulta ang absorbance na walang haba ng landas. Isa itong sabi-sabi.

Nagmumula sa mekanismo ang disiplinang kailangan sa pagsukat. Hayaang umabot sa ekwilibriyo ang mga sample sa iisang temperatura bago sukatin. Gumamit ng parehong uri at oryentasyon ng cuvette, mga katugmang blank na may parehong nilalamang asin at buffer, at malinis na kagamitang salamin, dahil dumidikit ang methylene blue sa salamin at plastik sa pamamagitan ng adsorption at nag-iiwan ng bakas ng huling konsentradong sample ang isang cuvette na may mantsa. Sukatin kaagad matapos ihanda kapag mahalaga ang kinetika ng agregasyon, at buuin ang bawat kurba ng kalibrasyon sa parehong matrix at haba ng landas na ginagamit sa mga sample na hindi pa alam ang konsentrasyon. Para sa mga pagsusuring biswal, tandaan na hindi mahusay na spectrometer ang mata. Hiwalay na tanong kung mapatutunayan ng kulay ng solusyon ang kadalisayan, at hindi ang sagot dito; isa sa mga dahilan ang pagbabago ng tono ng kulay dahil sa agregasyon.

Isang diagram na dapat itabi sa instrumento

Binubuod ng larawan sa ibaba ang artikulo sa isang reperensiyang magagamit sa mesa ng laboratoryo. Pareho ang pangkulay ng tatlong solusyon ngunit magkaiba ang kabuuang konsentrasyon at nilalamang asin. Ipinapakita ng kanilang mga eskematikong spectrum na lumiliit ang bahagi ng banda ng monomer sa mahabang wavelength habang lumalaki ang bahagi ng banda ng dimer sa mas maikling wavelength kasabay ng pagdami ng pagpapatong. Nakaimprenta sa larawan ang mga kondisyon dahil kung wala ang mga ito, hindi muling magagamit ang mga kurba. Para sa mga nasukat na posisyon ng banda sa mga nakasaad na kondisyon, gamitin ang reperensiyang spektral. Para sa kung paano pumapasok sa mga selula ang pangkulay kapag nasa solusyon na ito, tingnan ang pagpasok sa selula sa pamamagitan ng reduksiyon at paghahati sa mga phase. Para sa kung paano higit na hinuhubog ng dami ng liwanag at heometriya ang mga resulta ng pagsukat na potokemikal, tingnan ang pagkakalantad sa liwanag at heometriya ng pagsukat.

May dalawang bahagi ang tuntuning dapat tandaan. Tinutukoy ng spectrum ang halong nasa cuvette sa mga nakasaad na kondisyon. Tanging kalibrasyong binuo sa mismong mga kondisyong iyon ang makapagpapalit ng absorbance tungo sa kabuuang konsentrasyon.