Mga alternatibo sa methylene blue para sa mikroskopya: pumili ayon sa gawain

Para sa isang simpleng bacterial smear, maaaring ipalit ang crystal violet sa methylene blue kapag ang layunin ay makita ang hugis ng cell. Para sa mga buhay na cell, maaaring mas angkop ang phase contrast nang walang anumang stain. Nakadepende ang pagpili sa obserbasyong kailangan mong gawin.

Ipagpalagay na dalawang tao ang sumusuri sa parehong bacterial culture. Gusto ng isa na matukoy ang pagkakaiba ng mga rod-shaped cell at mga bilog na cell. Gusto naman ng isa na malaman kung napatay ng isang treatment ang bacteria. Ang stain na nagbibigay sa unang tao ng malinaw na larawan ay maaaring hindi magbigay sa ikalawang tao ng kapaki-pakinabang na sagot.

Bago pumili ng kapalit, kumpletuhin ang pangungusap na ito: “Kailangan kong obserbahan ang ___ sa ___, at kailangan / hindi kailangang manatiling buhay ang mga cell.” Ang pangungusap na iyon ang nagtatakda sa gawaing kailangang gampanan ng stain.

Magsimula sa specimen at sa tanong

Una, tukuyin kung kailangang manatiling buhay ang mga cell, pagkatapos ay tukuyin ang feature na kailangan mong obserbahan:

• Kailangang manatiling buhay ang mga cell: para sa paggalaw o hugis, isaalang-alang ang unstained phase contrast o DIC; para sa nuclear DNA, isaalang-alang ang Hoechst 33342 na may fluorescence; para sa membrane integrity, pumili ng validated assay gaya ng SYTO 9 na may propidium iodide.
• Hindi kailangang manatiling buhay ang mga cell: para sa bacterial morphology, isaalang-alang ang crystal-violet simple stain o nigrosin negative stain; para sa Gram reaction, gamitin ang kumpletong Gram-stain method; para sa nuclear DNA sa fixed cells, isaalang-alang ang DAPI fluorescence.

Gamitin ang talahanayang ito upang paghambingin ang mga limitasyon ng bawat sangay. Mga pagpili ito ng method, hindi mga tagubilin na magpalit ng mga bote sa loob ng isang umiiral nang protocol.

Para sa isang simpleng smear, maingat na palitan ang method

Praktikal na kandidato ang crystal violet kapag ang gawain ay isang single-color na pagtingin sa bacterial morphology. Inililista ng Bacteriological Analytical Manual ng FDA ang dalawang crystal-violet formulation na angkop para sa simple staining. Gumamit ng documented formulation at ng preparation method nito; hindi sapat ang pangalan lamang ng dye upang matukoy ang isang gumaganang reagent.

Ginagamit din ang crystal violet sa Gram staining, ngunit hindi nito ginagawang Gram stain ang isang crystal-violet simple stain. Sa ASM Gram-stain protocol, nakadepende ang differential result sa sunod-sunod na pagkilos ng crystal violet, iodine, decolorization, at counterstaining. Kapag inalis ang mga hakbang na iyon, nagbabago kung ano ang maaaring patunayan ng larawan. Tingnan ang simple staining kumpara sa Gram staining para sa pagkakaibang iyon.

Nagbibigay ang nigrosin ng ibang paraan upang makita ang mga outline: pinapadilim nito ang background habang nananatiling mas maliwanag ang mga bacterial cell kung ihahambing. May mahalagang detalye sa mga tagubilin ng Merck para sa nigrosin na maaaring hindi makita sa isang pangkalahatang listahan ng mga kapalit. May formaldehyde ang tinukoy nitong working formulation. Samakatuwid, hindi mo maaaring ipagpalagay na compatible ito sa live cells dahil lamang sa mga salitang “negative stain,” kahit na mukhang walang stain ang mismong mga cell. Suriin ang kumpletong formulation at specimen preparation.

Para sa mga buhay na specimen, isaalang-alang ang pagbabago ng optics

Kung gusto mong obserbahan ang paggalaw o paghahati ng mga cell, maaaring gawing mas komplikado ng pagdaragdag ng isa pang dye ang obserbasyon. Gaya ng paliwanag ng Nikon sa gabay nito tungkol sa contrast sa mga transparent na specimen, ginagawang nakikita ng phase contrast at differential interference contrast, o DIC, ang mga specimen sa pamamagitan ng mga pagkakaiba sa kanilang optical properties. Maaari nilang ipakita ang mga buhay at unstained na cell, kung taglay ng microscope ang kinakailangang mga component.

Pinananatili ng pagpiling ito na walang stain ang preparation, ngunit binabago nito ang impormasyong makukuha. Maaari mong sundan ang isang boundary o paggalaw nang hindi nalalaman kung aling molecule ang sanhi ng contrast. Kung molecular localization ang tanong, pumili sa halip ng naaangkop na labeling method.

Para sa nuclear DNA, tinutukoy ng paghahambing ng Invitrogen sa DAPI at Hoechst stains ang karaniwang paggamit ng DAPI sa fixed cells kumpara sa Hoechst 33342 na mas madaling makapasok sa cell at mas pinipili para sa live-cell labeling. Pareho silang nangangailangan ng fluorescence equipment. Wala sa dalawa ang direktang kapalit ng isang colored brightfield stain.

Ituring ang dye exposure at illumination bilang experimental conditions. Paghambingin ang stained at unstained preparations kapag ang behavior ng mga cell ang iyong sinusukat.

Ang pulang cell ay hindi awtomatikong patay na cell

Madalas na pinagtatambal ang SYTO 9 at propidium iodide upang suriin ang bacterial membrane integrity. Iniuugnay ng BacLight manual ang intact membranes sa green staining at ang damaged membranes sa red staining. Kailangang i-validate ang interpretasyong iyon para sa specimen.

Ipinapakita ng isang 2019 study nina Rosenberg at mga kasamahan ang problema. Sa 24-hour E. coli biofilms sa salamin na nasa phosphate-buffered saline, humigit-kumulang 96% ng mga cell ang mukhang propidium-iodide-positive in situ. Gayunman, tinantiya ng mga may-akda na 82% ang cultivable pagkatapos ng harvesting. Ipinakita ng confocal images ang mga cell na may berdeng interior sa ilalim ng red-stained material, na nagpapahiwatig na maaaring extracellular nucleic acids ang sanhi ng mapanlinlang na signal.

Inilalarawan ng mga porsiyentong iyon ang magkakaibang measurement sa mga preparation ng study, hindi isang universal correction factor. Ang mahalagang aral ay suriin kung ano ang bumuo ng signal. Sa isang biofilm, maaaring ma-detect ng nucleic-acid dye ang material sa labas ng mga cell pati na rin sa loob ng mga damaged cell. Para sa isang konklusyon tungkol sa viability, inirerekomenda ng mga researcher ang complementary measurements, gaya ng cultivation o metabolic activity, habang kinikilalang may mga limitasyon ang bawat isa.

Suriin kung ano talaga ang nilalaman ng alternatibo

Maaaring naglalaman pa rin ng methylene blue ang isang alternatibong staining method. Halimbawa ang Giemsa: inilalarawan ng Merck ang produkto nito bilang isang azure-eosin-methylene-blue solution, na inilaan para sa mga application kabilang ang blood at bone-marrow smears. Maaari itong maging ibang method para sa ibang specimen, ngunit hindi nito natutugunan ang requirement na ibukod ang methylene blue.

Kung bahagi ng experiment ang pagbubukod ng isang compound, suriin ang reagent identity at formulation bago paghambingin ang mga image. Tinatalakay ng gabay sa methyl blue, methylene blue, at mga dye na may magkakatulad na pangalan ang mga pagkakaiba sa pangalan.

I-verify ang substitution bago gamitin ang resulta

Para sa isang bagong method, gumawa ng maliit na paghahambing gamit ang representative specimens at isang naaangkop na control. Panatilihing maihahambing ang microscope settings kung posible. Itala ang reagent formulation, specimen preparation, exposure, at imaging conditions upang maimbestigahan ang isang larawang mas maganda ang hitsura sa halip na basta piliin ito.

Suriin ang tagumpay batay sa orihinal na tanong. Para sa morphology, suriin kung nananatiling interpretable ang mga boundary at arrangement ng cell. Para sa nuclear labeling, suriin ang signal location at background. Para sa viability, mangailangan ng ebidensyang higit pa sa kaakit-akit na paghihiwalay ng mga kulay. Ipinapaliwanag ng mas malawak na gabay sa methylene blue staining at mga laboratory application kung paano nagtutugma ang obserbasyon at preparation.

Piliin ang alternatibong nagpapanatili sa measurement na kailangan mo. Isa lamang ang kulay sa mga property ng nagreresultang image.