Methylene Blue at Senesensiya ng Selula: Paliwanag sa mga Sukatan sa Fibroblast

Ganito ang isang karaniwang maling pagbasa. Iniulat ng isang papel na nagdagdag ang methylene blue ng mahigit 20 pagdodoble ng populasyon sa mga fibroblast na pinalago sa kultura, kaya ipinapalagay ng mambabasa na inaalis nito ang mga selulang senesente o pinahahaba ang buhay ng tao nang katumbas na halaga. Tila likas ang ganitong paghihinuha. Mali rin ito sa dalawang magkahiwalay na punto.

Konseptuwal, hindi numerikal, ang pangunahing problema. Magkakaibang tanong ang sinasagot ng pagdodoble ng populasyon, mga pananda ng senesensiya, at mga sukat ng telomere. Pinakamainam basahin ang pananaliksik sa fibroblast at methylene blue bilang pag-aaral ng naantalang pagpasok sa senesensiya ng isang uri ng selula sa isang lalagyan ng kultura, na sinusuportahan ng mga sukat ng mitochondria. Iba ito sa piling pag-aalis ng mga selulang senesente na, at iba rin sa pagtanda ng buong organismo. Ang mas malawak na konteksto ng pagkakaibang iyon ay bahagi ng kung paano hinuhubog ng transportasyon ng elektron sa mitochondria ang enerhiya ng selula at kung paano dapat unawain ang mga pahayag mula sa pananaliksik sa methylene blue.

Kasaysayan, hindi kabataan, ang binibilang ng pagdodoble ng populasyon

Karamihan sa mahahalagang resulta ay mula sa mga selulang IMR90, isang strain ng normal na fibroblast mula sa baga ng fetus ng tao na may limitadong kakayahang dumami. Sa unang pag-aaral sa methylene blue at haba ng buhay ng pagdami ng mga IMR90 fibroblast, inililipat ang mga kultura sa bagong lalagyan ayon sa iskedyul at itinatala ang pinagsama-samang pagdodoble ng populasyon hanggang sa tumigil sa paghahati ang kultura. Ang paglalapat sa antas na nanomolar, na nakasentro sa 100 nM, ay nagbigay-daan sa mga kultura na makaipon ng mahigit 20 karagdagang pagdodoble bago huminto.

Ang isang pagdodoble ng populasyon ay yunit ng pagtatala. Itinatala nito kung ilang beses humigit-kumulang dumoble ang populasyon. Hindi nito direktang sinasabi kung ang isang indibiduwal na selula ay senesente, pansamantalang hindi naghahati, may espesyalisadong tungkulin na, o patay. Maaaring madagdagan ang pagdodoble ng isang kultura dahil nananatiling may kakayahang maghati ang mga selula nang mas matagal, dahil mas kaunti ang maagang humihinto dahil sa stress, o dahil pinapaboran ng mga kondisyon ang isang subpopulasyong aktibong dumarami. Hindi kayang paghiwalayin ng bilang lamang ang mga landas na iyon.

Kaya ipinapareha ang bilang ng pagdodoble sa mga pananda. Ipinapakita ng bilang kung gaano katagal nagpatuloy ang pagdami. Ipinapakita naman ng mga pananda kung anong kalagayan ang pinasukan ng mga selulang huminto o nanatiling buhay.

Gabay sa mga sukatan: ano ang ipinapakita ng bawat pananda

Ang senesensiya sa kultura ay isang penotipong tinutukoy gamit ang ilang magkakahiwalay na pagsukat. Walang iisang pangkulay o protina na nagpapatunay nito.

Paghinto ng paglaki na may pagkawala ng sintesis ng DNA. Sinusuri ang pangmatagalang paghinto sa pamamagitan ng nabawasang pagsasama ng BrdU o EdU, patag na anyo ng selula, at kawalan ng muling paglaki matapos ilipat sa bagong lalagyan. Ibinubukod nito ang senesenteng paghinto mula sa pansamantalang hindi paghahati.

Beta galactosidase na kaugnay ng senesensiya. Kinukulayan ng SA-beta-gal ang aktibidad ng mga lysosome malapit sa pH 6.0. Madalas na positibo sa pangkulay ang mga senesenteng fibroblast habang dumarami ang materyal ng lysosome. Hindi ito espesipiko, kaya binabasa ito kasama ng mga pananda ng pagdami at mga molekular na pananda.

Mga landas ng p16 at p21. Kumikilos ang p16 sa pamamagitan ng CDK4 at CDK6 at ng landas ng RB. Madalas na napapataas ang p21 sa pamamagitan ng p53. Sumusuporta sa paghinto ang tumataas na mga antas, ngunit hindi eksklusibo sa senesensiya ang alinman sa dalawang protina.

Kalagayan ng pagtatago ng mga sangkap. Ang penotipo ng pagtatago na kaugnay ng senesensiya, o SASP, ay tumutukoy sa nabagong paglalabas ng mga cytokine, chemokine, growth factor, at protease. Inilalarawan ng mga pagsusuri ng RNA o protina para sa mga salik ng SASP kung paano nagpapadala ng senyas ang mga selula sa mga katabi nila. Hindi nito direktang sinusukat ang kakayahang dumami.

Mga oxidant at sukat ng mitochondria. Nagdaragdag ang mga papel sa methylene blue ng pagsusuri sa mitochondria: dami at aktibidad ng complex IV, pagkonsumo ng oxygen, sintesis ng heme, dami ng materyal ng lamad, potensiyal ng lamad, ATP, at mga senyas ng oxidant. Inilalarawan ng mga ito ang kalagayang metaboliko na kasabay ng naantalang paghinto. Hindi nila sa sarili lamang tinutukoy ang senesensiya, ngunit sinusubok nila ang iminungkahing mekanismo. Inilatag ang modelo ng pag-ikot ng redox, kung saan nire-reduce ng NAD(P)H ang methylene blue at muling ino-oxidize ito ng cytochrome c, sa parehong pag-aaral sa IMR90 na nag-uugnay sa pag-ikot ng redox at mas mababang produksyon ng oxidant. Tinatalakay ang kaugnay na lohika ng dosis at distribusyon sa parmakolohiya ng methylene blue at pagkakalantad ng tisyu rito.

Bilis ng pag-ikli ng telomere. Ang tamang yunit ay bilang ng pares ng base na nawawala sa bawat pagdodoble sa loob ng ilang linggo, hindi haba sa isang takdang oras lamang. Ang mas mabagal na pag-ikli ay nangangahulugang mas kaunting pag-ikli sa bawat replikasyon. Hindi ito nangangahulugang humahaba ang telomere, at maaaring pahintuin ng stress ang mga selulang IMR90 kahit kaunti lamang ang pagbabago sa telomere.

Paghahambing ng tatlong disenyo ng pag-aaral sa fibroblast

Ang orihinal na materyal para sa pahinang ito ay ang paghahambing sa ibaba. Pinagsasama nito sa iisang tanaw ang uri ng selula, pagkakalantad, pagsukat, at limitasyon.

Pag-aaral	Mga selula at pagkakalantad	Ano ang sinukat	Ano ang hindi nito maipapakita
Atamna et al., FASEB J 2008	Mga normal na IMR90 fibroblast, pangmatagalang nanomolar na methylene blue, 100 nM bilang pamantayang kondisyon	Pinagsama-samang pagdodoble, dami ng complex IV, pagtaas ng pagkonsumo ng oxygen nang 37 hanggang 70 percent, sintesis ng heme, pagpigil sa maagang senesensiyang dulot ng hydrogen peroxide o cadmium, mga enzyme ng phase 2 sa mga selulang HepG2	Walang pagsusuri sa pag-aalis ng mga selulang senesente. Walang sukatan ng haba ng buhay ng hayop o tao. Ang haba ng buhay ng pagdami rito ay nangangahulugang pagdodoble sa isang lalagyan ng kultura.
Atamna et al., Redox Biology 2015, na inilarawan sa kasunod na pag-aaral sa mekanismo ng AMPK at pagbuo ng complex IV	Mga IMR90 fibroblast, pangunahing 100 nM methylene blue, na may AICAR bilang panghambing na pangmatagalang tagapag-aktibo ng AMPK	Pagbabago sa paglipas ng panahon ng ratio ng NAD sa NADH, panandaliang posporilasyon ng AMPK, pagpapataas ng PGC-1alpha at SURF1, pagtaas nang mahigit 100 percent sa aktibidad ng complex IV, 28 percent na mas mababang oxidant, mas mabagal na pag-ikli ng telomere, humigit-kumulang 18 karagdagang pagdodoble kumpara sa humigit-kumulang 2 sa AICAR, walang epekto sa siklo ng selula	Ang paghahambing sa AICAR ay may pagkakaiba sa dosis na humigit-kumulang 1000 beses at sa pagiging espesipiko, kaya padron ng pag-aktibo ang sinusubok nito sa halip na magkatumbas na lakas ng epekto. Nalalapat ang resulta sa telomere sa mga kulturang naghahati sa loob ng ilang linggo.
Xiong et al., Aging Cell 2016, na iniulat sa pag-aaral sa mga fibroblast ng progeria tungkol sa pagpapanumbalik ng mitochondria at nukleo	Mga pangunahing fibroblast ng balat mula sa Hutchinson-Gilford progeria kasama ang itinugmang normal na kontrol, karaniwang 100 nM sa loob ng 5 hanggang 12 linggo	Hugis ng mitochondria gamit ang fluorescence at electron microscopy, kakayahang gumalaw gamit ang pagkuha ng larawan habang buhay ang mga selula, superoxide, potensiyal ng lamad, ATP, PGC-1alpha, mga pananda ng pagdami at senesensiya, kasama ang mga umbok ng nukleo, lokasyon ng progerin, heterochromatin, at ekspresyon ng gene	Modelo ng maagang pagtandang espesipiko sa sakit, hindi normal na pagtanda. Ang pagpapanumbalik ng anyo at mga pananda ay hindi pag-aalis ng mga selulang senesente. Walang sukatan ng bisa sa hayop o klinikal na resulta.
Xue et al., pagsusuring-pampanitikan sa Cells 2021, na binuod sa pagsusuri sa methylene blue bilang kandidatong sangkap laban sa pagtanda	Sintesis ng literatura sa pagtanda ng utak, neurodegenerasyon, balat, paghilom ng sugat, at progeria	Inilalarawan ang methylene blue bilang katalitikong tagapagpaikot ng redox na maaaring lumampas sa ilang bahagi ng daloy sa complex I at III, sa konteksto ng mga teorya ng pagtanda na nakabatay sa mga free radical	Naratibong sintesis lamang. Inaayos nito ang mga hipotesis at tinutukoy kung saan nananatiling hindi tiyak ang klinikal na ebidensiya.

Mas mahalaga ang padron sa kabuuan ng mga hanay kaysa sa alinmang isang hanay. Paulit-ulit na nauugnay ang mababang dosis ng methylene blue sa mas mahabang panahon ng pagdami, mas mataas na aktibidad ng complex IV, mas mababang mga senyas ng oxidant, at mas maayos na anyo ng selula. Nananatiling pangmatagalang pagsubaybay ang disenyo: magsimula sa mga selulang naghahati, ilapat ang sangkap habang dumarami ang mga ito, at itala kung gaano katagal nagpapatuloy ang paghahati. Maaaring suportahan ng ganitong balangkas ang pahayag ng pagpapaliban. Hindi nito kayang suportahan ang pahayag ng pag-aalis kung walang ibang disenyo.

Ang pagpapaliban ng senesensiya ay hindi pag-aalis ng mga selulang senesente

Ang pagpapaliban ay nangangahulugang patuloy na naghahati ang mga selulang naghahati na nang mas matagal bago huminto. Ang pag-aalis, na madalas tawaging senolitikong epekto, ay nangangahulugang piling pinapatay o binabawasan ang mga selulang senesente na habang nananatiling buhay ang mga katabing dumaraming selula.

Sinusubok ng literatura sa methylene blue at fibroblast ang unang balangkas. Nagsisimulang aktibong dumarami ang mga kultura, tumatanggap ng sangkap habang sunod-sunod na inililipat sa bagong lalagyan, at mas huling humihinto. Kaya ang mga pananda gaya ng SA-beta-gal, p16, p21, at mga salik ng SASP ay lumilitaw nang mas huli o sa mas mababang antas sa isang takdang yugto ng paglilipat. Inaasahan ang ganitong padron tuwing naaantala ang pagsisimula. Hindi nito pinatutunayang naalis ang anumang selulang senesente na.

Mangangailangan ang isang senolitikong pahayag ng ibang paghahanda: unahing dalhin ang kultura sa napatunayang senesensiya, saka ilapat ang sangkap, at pagkatapos ay ipakita ang piling pagkawala ng mga selulang senesenteng iyon kumpara sa mga dumaraming kontrol, gamit ang direktang pagsukat ng pananatiling buhay at pagkamatay. Hindi sapat ang pagbaba ng isang pananda lamang dahil maaaring magbago ang ekspresyon nang walang pagkawala ng selula, at maaaring dumami sa lalagyan ang natitirang mga selulang naghahati. Wala sa apat na binanggit na sanggunian ang gumagamit ng disenyong iyon ng piling pagbabawas para sa methylene blue, kaya ang tumpak na tawag ay aktibidad na nagpapaliban ng senesensiya o laban sa senesensiya in vitro, hindi senolitiko. Mas ipinapaliwanag ang bahagi ng pagkakaibang ito na may kinalaman sa oksidatibong stress sa kung paano kinokontrol ng mga selula ang mga reaktibong uri ng oxygen.

Lalong nililinaw ng resulta sa panandaliang pagsesenyas ang puntong ito. Sa pag-aaral sa IMR90 noong 2015, nagdulot ang methylene blue ng maikling pagtaas sa ratio ng NAD sa NADH at maikling posporilasyon ng AMPK, na sinundan ng pagpapataas ng PGC-1alpha at SURF1, na parehong kaugnay ng pagbuo ng complex IV. Higit na mas mahina ang naging resulta ng pangmatagalang pag-aktibo ng AMPK gamit ang AICAR pagdating sa karagdagang pagdodoble.

Ang haba ng buhay ng pagdami ng selula ay hindi haba ng buhay ng tao

Binibilang ng haba ng buhay ng pagdami ng selula ang mga pagdodoble bago huminto sa isang kontroladong lalagyan na may nakapirming oxygen, medium ng kultura, at ritmo ng paglilipat. Pinagsasama naman ng haba ng buhay ng tao ang mga dekada ng pag-unlad, imyunidad, sistema ng mga daluyan ng dugo, mga lokal na kapaligiran ng stem cell, pag-uugali, at sakit. Maaaring pahabain ng isang sangkap ang una nang walang pagbabago sa ikalawa, at ganoon ang nangyayari sa karamihan.

Ang mga fibroblast ng progeria ay may isang tiyak na mutasyon sa LMNA na lumilikha ng progerin, kasama ang pira-piraso at hindi gaanong gumagalaw na mitochondria, mababang ATP, mga nukleong hindi normal ang hugis, at pagkawala ng heterochromatin. Napabuti ng nanomolar na methylene blue ang mga sukat ng mitochondria at lubhang naibalik ang mga sukat ng nukleo, kabilang ang pagkalaya ng progerin mula sa lamad. Kapansin-pansin ang pagpapanumbalik na iyon sa antas ng selula. Resulta pa rin ito sa fibroblast, at itinuring ng mga may-akda ang pagsusuri sa hayop bilang gawain sa hinaharap. Mas tinatalakay ang modelo ng sakit mismo sa methylene blue sa progeria at mga modelo ng maagang pagtanda.

Mula rito, mabubuo ang isang praktikal na talaan ng mga dapat suriin sa pagbabasa.

Itanong kung nagsimula ang paglalapat bago huminto ang paghahati o matapos matiyak ang paghinto. Sinusuportahan ng una ang pagpapaliban. Para sa pag-aalis, kailangan ang paglalapat pagkatapos huminto kasama ang datos ng piling pagkamatay.
Itanong kung ano ang naging kurba ng pagdodoble ng kontrol. Kung walang pinagsama-samang pagdodoble, walang malinaw na batayan ang mga pagbabago sa pananda.
Humingi ng hindi bababa sa dalawang klase ng pananda, gaya ng pananda ng pagdami kasama ang p16 o p21 at SA-beta-gal, sa halip na iisang pangkulay lamang.
Itanong kung paano iniulat ang mga telomere. May kabuluhan ang bilis sa bawat pagdodoble sa paglipas ng panahon. Wala nito ang iisang sukat ng haba sa isang sandali.
Itanong kung ano ang pinanatiling pare-pareho. Ang densidad sa paglilipat, oxygen, pagpapalit ng medium, at bago kumpara sa matagal nang nakaimbak na methylene blue ay pawang nakapagbabago sa paghinto ng mga fibroblast.

Kapag binasa sa ganitong paraan, nagbibigay ang literatura sa fibroblast ng malinaw ngunit limitadong papel para sa methylene blue: isang sangkap na aktibo sa redox sa mababang dosis na nagpapaliban ng senesensiya sa pagdami ng mga fibroblast ng tao sa kultura habang pinapabuti ang mga sukat ng mitochondria, na may pinakamatibay na detalye sa mekanismo ng panandaliang pagsesenyas ng enerhiya at pagbuo ng complex IV, at walang pagpapakita sa mga papel na ito ng pag-aalis ng mga selulang senesente o pagpapahaba ng buhay ng tao.