Methylene blue at ferroptosis: bakal, peroksidasyon ng lipid, at pagkamatay ng selula

Ang ferroptosis ay pagkamatay ng selula dahil sa pinsala sa lamad. Ang mga polyunsaturated na taba sa mga lamad ay sumasailalim sa oksidasyon sa isang kadena ng mga reaksiyon, nawawalan ng kakayahang gumana ang lamad, at namamatay ang selula. Kailangan ang bakal para sa prosesong kemikal na ito. Iyon ang buong konsepto, at lahat ng nasa artikulong ito ay pagsubok sa isang bahagi nito.

Mas tiyak ang tanong dito: ano ang ginagawa ng methylene blue sa kadenang iyon sa mga eksperimento sa selula, at ano talaga ang ipinapakita ng resulta. Ang maikling sagot ay sa dalawang pag-aaral sa laboratoryo, binawasan ng methylene blue sa konsentrasyong nanomolar ang peroksidasyon ng lipid sa mitochondria at pinanatiling buhay ang mga selula matapos ilantad sa mga pampasimula na kung wala nito ay nagdudulot ng ferroptosis. Mas mahalaga ang mas mahabang sagot, dahil sinubok ang bawat kawing ng kadena gamit ang magkakaibang interbensiyon, at may mga limitasyon ang bawat interbensiyon.

Ferroptosis sa isang talata

May mahinang bahagi ang isang phospholipid sa lamad na may buntot na polyunsaturated fatty acid: mga atomo ng hydrogen na madaling maagaw. Kapag naagaw ng isang radikal ang isa, kumakabit ang oxygen sa lipid, nabubuo ang isang lipid peroxyl radical, at nang-aagaw naman ang radikal na iyon mula sa kasunod na lipid. Kumakalat ang reaksiyon sa kahabaan ng lamad maliban kung may pumigil dito.

Ang pangunahing pumipigil dito ay isang enzyme na tinatawag na GPX4, na gumagamit ng glutathione upang gawing hindi nakapipinsalang mga lipid alcohol ang mga lipid peroxide sa pamamagitan ng reduksiyon. Inaatake ng mga pampasimula sa laboratoryo ang depensang ito sa mga tiyak na punto. Hinaharangan ng erastin ang pagpasok ng cystine sa pamamagitan ng system xc-minus, kaya kinakapos ang selula sa cysteine para sa sintesis ng glutathione. Direktang hinaharangan ng buthionine sulfoximine ang sintesis ng glutathione. Pinipigilan naman ng RSL3 ang mismong GPX4. Dahil sa tatlo, hindi naaalis ang mga peroxide, ngunit ginagawa nila ito sa magkakaibang hakbang, kaya ang resulta sa isang pampasimula ay hindi awtomatikong naaangkop sa iba.

Naiiba ang ferroptosis sa apoptosis sa mga katangiang nagtatakda rito. Walang sunod-sunod na pag-activate ng caspase at walang mga apoptotic body. Sinusupil ito ng mga chelator ng bakal gaya ng deferoxamine at mga ahenteng humuhuli ng radikal gaya ng ferrostatin-1. Ito ang praktikal na pagsusuring ginagamit ng mga mananaliksik upang tawaging ferroptotic ang pagkamatay sa halip na necrotic lamang. Nagbibigay ng konteksto sa pagkakaibang ito ang mas malawak na hanay ng mga landas ng reguladong pagkamatay ng selula, at ipinapaliwanag ng paraan ng paghawak ng mga selula sa madaling makilahok sa reaksiyon na bakal kung bakit napakahalaga ng chelation bilang kontrol.

Saan pumapasok ang mitochondria, at bakit ito pinagtalunan

Iniulat ng mga naunang pag-aaral na dumaranas pa rin ng ferroptosis ang mga selulang walang mitochondrial DNA, na nagpapahiwatig na hindi kailangan ang mitochondria. Natuklasan ng mga sumunod na pag-aaral na ang pagbawas sa mitochondria, o pagharang sa respirasyon, ay maaaring sumupil sa ferroptosis mula sa kakulangan ng cysteine ngunit hindi sa ferroptosis mula sa direktang pagsugpo sa GPX4. Maaaring parehong tama ang mga resulta kung nakadepende ang ambag ng mitochondria sa pampasimula, uri ng selula, at lugar kung saan nagaganap ang mapagpasiyang peroksidasyon.

Nilapitan ng pag-aaral na pinagbabatayan ng artikulong ito ang pagtatalo gamit ang isang probe na tiyak sa isang kompartimento. Ang MitoCLox ay bersiyong nakatuon sa mitochondria ng isang tagapagpahiwatig ng peroksidasyon ng lipid: nagbabago ang fluorescence nito kapag nakatagpo ito ng mga lipid peroxyl radical sa loob ng mitochondria. Sa mga fibroblast na nilagyan ng erastin, lumitaw ang oksidasyon ng probe sa mitochondria sa mga buhay pang selula bago ang pagkamatay, at magkakaiba ito sa buong populasyon. Mahalaga ang pagkakasunod na iyon. Ang peroksidasyong nauuna sa pagkamatay ay isang posibleng sanhi. Ang peroksidasyong sinusukat lamang sa mga patay na selula ay mga labi ng pinsala. Tinatalakay ng kasamang gabay sa mga pagsusuri ng peroksidasyon ng lipid at kung ano ang ipinapakita ng bawat probe kung bakit ang lokasyon ng probe ang nagtatakda ng kahulugan ng isang signal.

Lumitaw ang parehong padron sa ikalawang modelo. Ang mga fibroblast mula sa isang pasyenteng may Leber hereditary optic neuropathy, na may mutasyon sa complex I at mas mataas na panimulang antas ng oxidative stress, ay namatay sa ferroptosis nang maubos ang glutathione, samantalang nakayanan ito ng mga kontrol na fibroblast. Muli, nauna ang oksidasyon ng probe sa mitochondria. Nasa pag-aaral sa mga fibroblast tungkol sa peroksidasyon ng lipid sa mitochondria sa ferroptosis ang mga detalye.

Ano ang binago ng methylene blue sa mga eksperimentong ito

Ang methylene blue ay isang tagapagdala sa mga reaksiyong redox. Ang oksidadong anyo nito ay tumatanggap ng mga electron mula sa mga prosesong kemikal na kaugnay ng NADH sa complex I, at ibinibigay naman ng nareduksiyong anyo nito ang mga electron sa cytochrome c, na naghahatid sa complex IV. Lumilikha ito ng bahagyang alternatibong daan na lumalampas sa bahagi ng kadena kung saan karaniwang tumatagas ang mga electron patungo sa oxygen upang bumuo ng superoxide. Ang mga mambabasang nais makita ang buong larawan ng pagpapasahan ay dapat magsimula sa kung paano inililipat ng methylene blue ang mga electron sa mitochondria.

Sa mga fibroblast ng baga na nilagyan ng erastin, napanatili ng methylene blue sa 250 nanomolar ang kakayahang mabuhay ayon sa isang pagsusukat ng kaligtasan ng selula, kasama ng mga antioxidant na nakatuon sa mitochondria na SkQ1 at MitoTEMPO. Ang mga kontrol ang nagtatakda ng saklaw ng pahayag. Nagbigay rin ng proteksiyon ang ferrostatin-1, alpha-tocopherol, at deferoxamine, na nagpapatunay na ferroptotic ang pagkamatay. Hindi nagbigay ng proteksiyon ang analog ng SkQ1 na walang pangkat na antioxidant, na nagtuturo sa prosesong redox sa halip na hindi tiyak na pag-iipon. Humina ang proteksiyon sa lampas humigit-kumulang 200 nanomolar SkQ1, na naaayon sa kilalang pro-oxidant na asal ng mga quinone antioxidant sa mas mataas na dami. May ganito ring dalawang magkasalungat na asal ayon sa dosis ang methylene blue: nagbibigay ito ng proteksiyon sa mababang antas na nanomolar sa mga lalagyang ito, ngunit maaari itong lumikha ng hydrogen peroxide sa pamamagitan ng paulit-ulit na redox cycling kapag mas mataas ang antas o malakas ang pagkakalantad sa liwanag. Tinatalakay ang ganitong konteksto ng dosis sa mga reaktibong uri ng oxygen sa mitochondria.

Pagkatapos, pinaghiwalay ng mga eksperimento sa nakahiwalay na mitochondria ang mga pinagmumulan ng ROS. Kapag may ferrous iron, pinasigla ng mga substrate na nagpapakain sa complex I kasama ng rotenone ang oksidasyon ng probe. Humaharang ang rotenone sa bahaging kasunod ng flavin site, kaya nananatiling nareduksiyon ang mga tagapagdala sa mga naunang bahagi at tumatagas ang mga electron patungo sa oxygen mula sa flavin na nakaharap sa matrix. Ang mga substrate na nagpapakain sa complex III kasama ng antimycin A ay lumikha ng maraming hydrogen peroxide ngunit hindi nagpasimula ng peroksidasyon ng lipid. Pareho ang kabuuang signal ng ROS, ngunit magkaiba ang lokasyon at kinalabasan. Parehong sinupil ng SkQ1 at methylene blue ang peroksidasyong dulot ng complex I nang hindi sinusupil ang mismong produksiyon ng hydrogen peroxide, kaya inilalagay nito ang kanilang pagkilos pagkatapos mabuo ang ROS, sa hakbang ng peroksidasyon ng lipid.

Ang bahagi ng pag-aaral sa sobrang bakal at ang palatandaan mula sa lipofuscin

Sinuri ng ikalawang pag-aaral ang tanong mula sa panig ng bakal. Ang mga H9c2 cardiomyocyte na inilantad sa ferric ammonium citrate sa konsentrasyong submillimolar ay nagkaroon ng ROS sa mitochondria, peroksidasyon ng lipid sa mitochondria, at pagkatapos ay ferroptosis, na sinundan ng pag-iipon ng pigmentong tulad ng lipofuscin sa loob ng 24 hours. Ang lipofuscin ay ang kusang nag-fluorescence at naglalaman ng bakal na labi ng mga naoksidang lipid at protina na naiipon habang tumatanda. Ang mabilis na paglitaw nito rito ay nag-uugnay sa biglaang peroksidasyong dulot ng bakal sa isang kilalang pananda ng pagtanda. Parehong napigilan ng methylene blue sa konsentrasyong nanomolar at ng SkQ1 ang peroksidasyon, pagkamatay, at pag-iipon ng pigmento. Pinagtibay ng nakahiwalay na mitochondria ng puso ang padron: nagpasimula ng peroksidasyon at signal na kahawig ng pigmento ang rotenone kasama ng ferrous iron, at parehong hinarangan ito ng dalawang ahente. Iniulat ang buong pagkakasunod-sunod sa pag-aaral ng sobrang bakal sa mga H9c2 cardiomyocyte. Kaugnay ng lipofuscin at mga pananda ng pagtanda ng selula ang bahagi ng kuwento tungkol sa pigmento.

Ano ang hindi ipinapakita ng mga pagsusuri sa kaligtasan ng selula

Ipinapakita ng isang pagsusukat ng kakayahang mabuhay gaya ng CellTiterBlue kung ilang selula sa isang lalagyan ang nananatiling aktibo sa metabolismo matapos ilantad sa isang pampasimula kasama ng isang posibleng tagaprotekta. Pagsubok iyon ng isang mekanismo sa isang tiyak na sistema. Hindi iyon kinalabasan ng paggamot. Wala sa mga eksperimentong ito ang nagbigay ng dosis sa isang pasyente, sumukat ng isang panghuling sukatan ng sakit, o nagtakda ng saklaw ng dosis na ligtas at kapaki-pakinabang para sa paggamot sa katawan.

Kailangang malinaw na banggitin ang apat na limitasyon. Una, limitado ang mga uri ng selula: mga nabagong fibroblast ng baga, mga pangunahing fibroblast ng balat kabilang ang isang linya mula sa may sakit sa mitochondria, at isang linya ng cardiomyocyte ng daga, kasama ng nakahiwalay na mitochondria mula sa puso ng daga. Nagkakaiba ang pagiging sensitibo ayon sa linya, at sadyang pinili ang linya ng LHON dahil sa pambihirang kahinaan nito. Ikalawa, matitinding kondisyon sa laboratoryo ang mga pampasimula: ganap na pagharang sa transportasyon o sintesis, at mga dami ng bakal na hindi biglang mararanasan ng anumang tisyu. Ikatlo, hindi naisasalin ang konsentrasyon sa simpleng pagpaparami. Ang nanomolar sa culture medium ay hindi dosis para sa tao. Ang distribusyon ng methylene blue, ang reduksiyon nito tungo sa walang-kulay na anyo sa dugo at tisyu, ang pagkakalantad sa liwanag, at ang potensiyal ng lamad ay pawang mga salik na naghihiwalay sa eksperimento sa lalagyan at sa isang tao. Ikaapat, sariling kompartimento lamang ang ipinapakita ng mga probe. Ipinapakita ng oksidasyon ng MitoCLox na nabuo ang mga radikal ng lipid sa mitochondria; hindi nito ipinapakitang direktang napigilan ang pagkapunit ng lamad ng selula, na malamang na huling pangyayari, sa halip na naiwasan ito sa mga naunang hakbang.

Kaya ito ang tapat na pahayag: sa mga modelong ito, ang ROS mula sa complex I kasama ng bakal ay nagtutulak ng peroksidasyon ng lipid sa mitochondria na nauuna sa ferroptosis, at pinuputol ng methylene blue sa mababang konsentrasyon ang bahaging iyon. Anumang lampas sa bahaging iyon ay nangangailangan ng ibang mga eksperimento sa mga hayop at pagkatapos ay sa mga tao.