Methylene blue bilang antioxidant at pro-oxidant: ano ang nagpapabago sa resulta?

Ipagpalagay na sinusuri ng dalawang laboratoryo ang parehong asul na tina at magkasalungat ang kanilang iniulat na resulta. Sa una, mas mahusay ang respirasyon ng nakahiwalay na mitochondria ng utak at mas marami itong nagagawang ATP. Sa ikalawa, higit na mas maraming hydrogen peroxide ang inilalabas ng parehong preparasyon. Parehong tama ang mga ulat. Inilalarawan nila ang parehong siklo mula sa dalawang magkaibang panig, at nagsisimula ang kalituhan kapag itinuturing ng mga mambabasa na ang isang panig ang buong kuwento.

Ang pagkakamali ay ang pagtatanong kung aling bansag ang nababagay sa molekula. Ang methylene blue ay tagapagpasa ng mga electron, gaya ng ipinapakita sa mas malawak na konteksto ng mapa ng mga target nito sa biyolohiya ng selula. Tumatanggap ng mga electron ang na-oxidize na tina at nagiging walang kulay na leucoMB. Ipinapasa ng leucoMB ang mga electron na iyon at nagiging asul muli. Ang naoobserbahan mo ay nakadepende sa kung sino ang nagbibigay ng mga electron, sino ang tumatanggap sa mga ito, at kung kayang alisin ng sistema ang hydrogen peroxide na nalilikha habang nagpapatuloy ang proseso. Ang mahalagang tanong ay hindi kung antioxidant ba ang tina. Ang tanong ay kung ano ang nagagawa ng pagpapasahan ng electron sa ilalim ng mga kondisyong iyon.

Ang siklong lumilikha ng dalawang mukha

Sa dilim, maikli ang pangunahing siklo. Nire-reduce ng NADH, NADPH, o mga tagapagdala sa kadena ng respirasyon ang tina. Pagkatapos, may magkakatunggaling landas ang na-reduce na tina. Maaari nitong ipasa ang mga electron sa cytochrome c at suportahan ang daloy na lumalampas sa isang nasirang complex, kaya bahagyang nakakabawi ang respirasyon at potensiyal ng lamad kapag hinaharangan ang complex I o III. O maaari nitong direktang ipasa ang mga electron sa oxygen, na muling bumubuo sa asul na anyo at lumilikha ng hydrogen peroxide. Dahil muling nabubuo ang tina, kayang ulitin ng maliit na dami nito ang siklong ito nang maraming beses, tuloy-tuloy na kumokonsumo ng mga reducing equivalent at lumilikha ng peroxide.

Dalawa pang sangay ang ganap na nagpapabago sa kimika. Binabago ng malayang copper o iron ang peroxide na iyon, na nakakalat sa pamamagitan ng diffusion, tungo sa higit na mapanirang mga lokal na oxidant sa pamamagitan ng mga reaksiyong uri ng Fenton. Nagbubukas ang pulang liwanag ng hiwalay na sangay ng photochemistry kung saan inililipat ng tina sa excited state ang enerhiya sa oxygen at lumilikha ng singlet oxygen, isang uri ng molekula na detalyadong tinatalakay sa paliwanag ng type I at type II na photochemistry. Ang redox cycling sa dilim, pinsalang pinalalala ng metal, at photodynamic na pinsala ay tatlong magkakaibang mekanismong nagkataon lamang na nagsisimula sa iisang molekula.

Matris ng mga kondisyon at resulta

Ang talahanayan sa ibaba ang mahalagang sangguniang dapat itabi. Bawat hanay ay naglalahad ng isang salik, ng direksiyong itinutulak nito, at ng eksperimento sa likod nito. Ang positibo ay nangangahulugang proteksiyon o mas magandang nasukat na resulta. Ang negatibo ay nangangahulugang mas maraming oxidant, mas matinding pagkaubos, o mas malaking pinsala.

Ang padron sa lahat ng hanay ang mahalagang punto. Magkahiwalay na dimensiyon ang paggawa ng peroxide at biyolohikal na proteksiyon. Maaaring negatibo ang resulta ng isang paggamot sa una at positibo naman sa ikalawa nang sabay.

Bakit magkaiba ang resulta sa parehong dosis

Itinatakda ng konsentrasyon ang kapasidad ng pagpapasa ng electron, hindi ang magiging kahihinatnan nito. Kapansin-pansing tumaas ang paglabas ng peroxide mula sa mitochondria ng utak mula 50 nM pataas sa pag-aaral ng buong mitochondria ng utak, samantalang kinailangan ang 100 uM sa dilim para sa malinaw na pinsala sa mitochondrial DNA. Humigit-kumulang dalawang libong ulit ang agwat sa pagitan ng unang senyas at genotoxicity, ngunit hindi ito palugit ng kaligtasan. Magkakaiba ang mga sukatan ng resulta, mga kompartimento, at tagal ng pagkakalantad, kaya ang mga bilang ay tumutukoy sa magkakahiwalay na penomeno sa halip na mga punto sa iisang kurba. Inilalagay ng talakayan tungkol sa tugon ayon sa dosis ang ganitong agwat sa pagitan ng mahinang senyas at matinding pinsala sa mas malawak na konteksto ng hormesis.

Ang substrate ang nagtatakda kung saan pumapasok ang mga electron. Ang mga pinagkukunan ng enerhiyang nakaugnay sa NADH ay nagbibigay sa tina ng maraming reducing equivalent para sa kapaki-pakinabang na alternatibong daan at sa reaksiyon sa oxygen na nagsasayang ng mga ito. Lumalampas sa ipinapakita ng datos ang madalas sipiing buod na ginagawang antioxidant ng succinate ang tina samantalang ginagawa itong pro-oxidant ng glutamate, dahil ang kondisyon ng peroxide na may succinate sa pag-aaral ng puso ay may rotenone rin at gumamit ng ibang tisyu at dosis kaysa sa pag-aaral ng utak na nakatuklas ng pagtaas ng peroxide sa bawat substrate at estado ng respirasyon.

Binabago ng liwanag ang mekanismo, hindi lamang ang laki ng epekto. Ang pinakamalinaw na paghahambing sa pangkat ay ang 20 uM sa dilim na walang nakikitang epekto sa mga fragment ng mitochondrial DNA, at ang 20 uM sa ilalim ng pulang liwanag na pumipinsala sa lahat ng mga ito. Sinumang naghahambing ng eksperimentong may liwanag sa isang nasa dilim ay naghahambing ng photochemistry sa redox cycling.

Binabago ng mga metal ang oxidant. Kung walang mga metal, lumilikha ang siklo ng tina sa dilim ng peroxide, isang molekulang nakakalat sa pamamagitan ng diffusion at ginagamit din ng mga selula bilang senyas. Kapag may copper o iron na magagamit sa reaksiyon, sinusuportahan ng tinang na-reduce ng NADH ang reduction ng metal, at binabago ng na-reduce na metal ang peroxide tungo sa mga uring hydroxyl o copper peroxide malapit sa DNA. Sa ganitong paraan nakalikha ang pag-aaral na walang mga selula gamit ang NADH at mga metal ion ng pinsalang pumipili ng mga hotspot at malawak na pinsala sa DNA mula sa parehong panimulang tina. Ang paghawak sa mga metal sa kompartimento, hindi ang tina lamang, ang nagtatakda kung mahalaga ang sangay na ito.

Ang kalagayan ng pinagkukunan ng enerhiya ang nagtatakda kung kayang sagutin ng selula ang kapalit. Sa mga endothelial cell na inilantad sa 2 hanggang 20 uM na tina, inilantad ng pag-alis ng glucose ang kapalit na oksidatibong stress, samantalang pinawi ito ng suplay ng glucose, kahit pinabilis din ng glucose ang reduction ng tina. Mas mabuti ang mas mabilis na siklong may sapat na suportang pananggol kaysa sa mas mabagal na siklong ubos ang mga pananggol. Ituring na hindi kumpleto ang anumang pahayag tungkol sa oxidant na hindi nagsasaad ng kalagayan ng glucose o NADPH.

Ang tisyu ang nagtatakda ng mga kasangkapang mayroon ang sistema. Muling bumubuo ng NADPH ang mga endothelial cell sa pamamagitan ng metabolismo ng glucose at may mga reserbang antioxidant sa cytosol. Wala ang lahat ng iyon sa nakahiwalay na mitochondria. Wala kahit pagkukumpuni sa purified DNA. Kaunti lamang ang naihuhula ng resulta sa isang preparasyon tungkol sa iba, kaya kailangang panatilihing magkahiwalay ang mga sistemang ito sa nakaplanong artikulo tungkol sa mga tugong partikular sa tisyu.

Ang direktang pagsukat ay hindi ang kasunod na depensa

Pinagsasama sa maraming sulatin ang dalawang antas na pinananatiling magkahiwalay ng mga eksperimento. Tinatanong ng isang antas kung gaano karaming oxidant ang lumitaw. Tinatanong naman ng isa kung paano tumugon ang selula.

Pinakamalapit sa unang antas ang mga pagsusuri ng peroxide na uri ng Amplex, at maging ang mga ito ay nag-uulat ng netong daloy, na nangangahulugang produksiyon na binawasan ng pagkasira at paglabas. Natuklasan ng pag-aaral ng mitochondria ng utak na parehong nagbago ang dalawang panig: mas maraming peroxide ang nabuo at mas mabagal ang pag-alis ng isang idinagdag na bolus ng peroxide. Mas malayo sa sunod-sunod na proseso ang oksidasyon ng glutathione, pagkonsumo ng ascorbate, na-oxidize na guanine, at mga pinsala sa DNA na humaharang sa polymerase. Bawat hakbang ay nagdaragdag ng biyolohikal na proseso sa pagitan ng oxidant at ng nasukat na resulta.

Nasa ikalawang antas ang mga antioxidant enzyme na pinapagana ng Nrf2 at ang mitochondrial biogenesis. Mga programang pang-angkop ang mga ito na maaaring mapasimulan ng banayad na pulso ng peroxide, at ang mga may-akda ng pag-aaral tungkol sa proteksiyon ng mitochondria ng utak ay nagmumungkahi mismo ng banayad na stress bilang tagapagpasimula habang binabanggit na ang magkakaugnay na sanhi sa pamamagitan ng Nrf2 ay nakabatay sa naunang mga pag-aaral sa halip na sa sarili nilang kumpletong pagpapakita. Ang proteksiyong dumarating makalipas ang ilang oras sa pamamagitan ng mga bagong protina ay hindi nangangahulugang antioxidant ang panimulang kimika. Nangangahulugan itong ang isang maliit na pro-oxidant na pangyayari ay nagbigay-daan sa mas malaking depensa. Ang mga gabay sa pagbasa ng ganitong mga pahayag, kabilang ang mga limitasyon ng pagsusuri at pagkakaiba ng mga preparasyon, ang paksa ng gabay sa pagbasa ng pananaliksik sa methylene blue.

Bakit hindi nagtutugma ang mga pagsusuri

Ang pangkalahatang probe tulad ng dihydrofluorescein ay nag-uulat ng malawak na oksidasyon ng probe, hindi ng konsentrasyon ng peroxide. Nakadepende ito sa kimika ng peroxidase at heme at maaaring hindi nito makita ang pagtaas ng peroxide na natutukoy ng isang naka-calibrate na Amplex assay. Nakita sa pag-aaral ng mitochondria ng utak ang matinding pagtaas ng peroxide na walang katumbas na senyas ng superoxide, na isang babala laban sa pagsipi ng anumang pahayag tungkol sa antioxidant na nakabatay lamang sa iisang tina. Makatuwirang isaalang-alang sa mga kontrol ang pag-o-overlap ng mga optical signal dahil sumisipsip ang tina ng nakikitang liwanag malapit sa mga karaniwang banda ng excitation at emission. Gayunman, nag-calibrate ang maingat na pag-aaral gamit ang kilalang dami ng peroxide, binawasan ang pagkakalantad sa liwanag na pang-excitation nang kakaunti lamang ang pagbabago sa senyas, at kinumpirma ang mas mabagal na pag-alis ng peroxide gamit ang hiwalay na electrode. Ang interference ay dapat suriin sa pamamagitan ng kontrol, hindi gamiting awtomatikong dahilan para tanggihan ang resulta.

Ipinapakita ng resulta sa calcium ang parehong pangangailangan para sa katumpakan. Hindi binago ng panandaliang pagbibigay ng tina ang kabuuang dami ng calcium bago ang permeability transition sa pag-aaral ng puso, ngunit pinahusay nito ang bilis ng pagsipsip ng calcium sa mitochondria ng utak na may pagharang sa pag-aaral ng mitochondria ng puso na nakatuon sa diabetes. Magkaibang sukatan ng resulta, magkaibang sistema, walang kontradiksiyon.

Isang talaan ng susuriin bago magtiwala sa konklusyon

Ituring ang bawat konklusyon na antioxidant o pro-oxidant bilang ulat tungkol sa isang sistema, at magtanong ng limang bagay. Sa anong konsentrasyon, at sa anong kompartimento. Anong tagapagbigay ng electron at anong katunggaling tagatanggap ang kasama. May liwanag ba o nasa dilim, at sa anong wavelength at dosis. Anong mga metal ang magagamit at anong mga pinagkukunan ng enerhiya at reserbang antioxidant ang may sapat na suporta. At anong pagsusuri ang ginamit, na sumusukat ba sa daloy ng oxidant, pinsala, o tugong pang-angkop. Baguhin ang alinman sa mga sagot at maaaring lumipat ang parehong molekula sa matris mula sa pagprotekta tungo sa pagdulot ng pinsala nang walang anumang kabalintunaan.