Methylene blue at multiple sclerosis: ano ang sinubok sa pananaliksik sa hayop

Kapag naghanap ka ng methylene blue para sa MS, makakakita ka ng mga pag-aaral na tila sumasagot sa iisang tanong. Hindi ganoon ang kaso. Sa isang pag-aaral, binigyan ng methylene blue ang mga may sakit na daga bilang paggamot. Sa isa naman, walang hayop na ginamot gamit ito. Ginamit ang methylene blue bilang asul na pangkulay sa maninipis na hiwa ng spinal cord upang makita ng isang patologo ang myelin sa ilalim ng mikroskopyo.

Ito ang pangunahing konsepto ng buong artikulo. Dalawa ang papel ng pangkulay na ito sa biyolohiya, at wala silang pagkakatulad maliban sa bote. Bilang kandidatong gamot, ibinibigay ito sa isang buhay na hayop at ang tanong ay kung nagbabago ang sakit. Bilang pangkulay, inilalagay ito sa patay na tisyu na naipreserba sa pamamagitan ng fixation pagkatapos ng eksperimento, at ang tanong ay kung ano ang hitsura ng tisyu. Kapag hindi mo napansin ang pagkakaibang iyon, mababasa mo ang seksiyon ng mga pamamaraan sa patolohiya na para bang resulta iyon ng paggamot.

Ano ang EAE, sa payak na paliwanag

Ang experimental autoimmune encephalomyelitis, na karaniwang pinaikli bilang EAE, ang karaniwang modelo sa hayop para sa ilang aspeto ng multiple sclerosis. Binibigyan ng mananaliksik ang isang dagang madaling kapitan nito ng bahagi ng protina ng myelin kasama ng malakas na adjuvant upang pasiglahin ang tugon ng sistemang panlaban sa sakit. Pagkatapos, inaatake ng sistemang ito ang sariling sentral na sistemang nerbiyos ng hayop. Nagkakaroon ang daga ng panghihinang nagsisimula sa ibabang bahagi at umaakyat, na madaling bigyan ng marka sa iskala mula 0 hanggang 5, mula sa nakalaylay na buntot hanggang sa pagkaparalisa ng mga paa sa likuran.

Ang pagiging madaling markahan nito ang dahilan kung bakit popular ang EAE, at kung bakit maaari rin itong makapanlinlang. Kusang umuusbong ang MS sa tao, may mas malawak at hindi gaanong tiyak na hanay ng mga target, at nagdudulot ng mga sintomas sa paningin, pandama, pag-iisip, cerebellum, at pagkilos, sa mga takbong pabalik-balik o patuloy na lumalala. Ginagaya ng EAE ang mga piling mekanismo tulad ng pamamaga, pagkawala ng myelin, at pinsala sa axon sa ilalim ng kontroladong mga kondisyon. Hindi nito ginagaya ang MS sa isang pinaliit na bersiyon. Maaaring balikan ng mga mambabasang nais ng pangkalahatang balangkas kung paano pinaniniwalaang kumikilos ang methylene blue sa antas ng selula bago suriin ang anumang pahayag tungkol sa isang partikular na sakit.

Magkaibang antigen para sa EAE rin ang ginamit ng dalawang pag-aaral sa ibaba, at mahalaga iyon. Pinukaw ng pag-aaral ng paggamot ang sakit gamit ang MOG35-55, isang maikling peptide mula sa myelin oligodendrocyte glycoprotein. Pinukaw naman ng pag-aaral ng patolohiya ang sakit gamit ang MP4, isang pinagsamang protina mula sa mga bahagi ng myelin basic protein at proteolipid protein. Naaapektuhan ng pagpili ng lahi ng daga at antigen kung saan lumilitaw ang mga sugat sa tisyu at kung paano kumikilos ang pamamaga, kaya hindi dalawang pag-ulit ng iisang eksperimento ang dalawang pag-aaral.

Ang gabay: mula sa modelo, tungo sa tanong, hanggang sa mga limitasyon

Panatilihing bukas ang talahanayang ito. Ito ang pangunahing sanggunian para sa artikulong ito. Nakasaad sa bawat hanay kung aling klinikal na tanong ang kayang tugunan ng modelo, kung ano ang aktuwal na sinukat, at kung saan nagtatapos ang maaaring ilapat sa tao.

Maaaring gamitin muli ng sinumang sumusuri sa susunod na ulo ng balita ang parehong mga kolum sa tulong ng paano basahin ang mga preklinikal na pag-aaral: itanong kung anong espesye at antigen ang ginamit, ano ang papel ng sangkap, ano ang mga sukatan ng kinalabasan, at kung ang resulta ay takbo ng sakit o larawan ng tisyu sa isang sandali.

Ang resulta ng paggamot: ano ang binago ng pagbibigay ng dosis

Gumamit ang pag-aaral ng paggamot noong 2016 sa Journal of Neuroimmunology ng mga babaeng dagang C57BL/6, mga 8 hanggang 10 linggong gulang, na binigyan ng 250 micrograms ng MOG35-55 bawat daga upang pukawin ang tugon ng sistemang panlaban sa sakit. Matapos pukawin ang sakit, sapalarang itinalaga ang mga hayop na may EAE sa grupong binigyan ng methylene blue o sa grupong may EAE na hindi ginamot, at sinubaybayan ang mga klinikal na marka hanggang humigit-kumulang araw 30.

Mula araw 15 hanggang araw 30, makabuluhang mas mababa sa estadistika ang mga klinikal na marka ng mga ginamot na daga kaysa sa mga kontrol na may EAE, sa P na mas mababa sa 0.01. Pareho ang ipinahiwatig ng pagsusuri sa spinal cord: mas kaunting pagpasok ng mga selulang kaugnay ng pamamaga, mas kaunting pagkawala ng myelin, at mas kaunting pagkawala ng axon sa mga ginamot na hayop.

Ang natatanging bahagi ay ang hanay ng mga pagsusuri sa pagsesenyas. Pinalakas ng paggamot ang pag-activate ng AMPK at ang ekspresyon ng SIRT1, at pinahina ang pag-activate ng NF-kB, isang sentral na tagapagbukas ng tugon ng pamamaga. Sa panig ng umaangkop na sistemang panlaban sa sakit, pinahina nito ang tugon ng Th17 at pinalakas ang tugon ng Treg. Kaya ang iminungkahing pagkakasunod-sunod ay mula sa methylene blue, tungo sa AMPK at SIRT1, tungo sa mas mahinang pagsesenyas ng NF-kB, tungo sa paglipat mula sa Th17 na nagtataguyod ng pamamaga patungo sa Treg na kumokontrol sa tugon, tungo sa mas banayad na pinsala sa tisyu, at tungo sa mas mababang mga marka.

Interpretasyon ang pagkakasunod-sunod na iyon, hindi napatunayang hanay ng sanhi at bunga. Ipinapakita ng pag-aaral na magkakasabay ang gamot, mga pagbabago sa pagsesenyas, at pagbuti ng sakit. Hindi nito pinatutunayang ang AMPK at SIRT1 ang responsable sa buong pakinabang, at hindi inilalahad ng tekstong nakatala sa mga pampublikong indeks ang eksaktong dosis sa milligram per kilogram, paraan ng pagbibigay, araw ng pagsisimula, o tagal nang sapat na malinaw upang maulit ang pamamaraan mula sa abstrak lamang. Ituring na hindi beripikado ang anumang bilang ng dosis na binabanggit tungkol sa pag-aaral na ito sa isang pahina ng pagbebenta, maliban kung sinisipi nito ang mga pamamaraan mula sa buong teksto. Sa mas malawak na kalipunan ng ebidensiya sa tao tungkol sa methylene blue dapat suriin kung ang maagang senyal na ito sa sistemang panlaban sa sakit ay humantong na sa klinikal na datos.

Ang resulta ng patolohiya: ano ang ipinakita ng tisyu sa loob ng anim na buwan

Gumamit ang pag-aaral ng MP4 noong 2015 sa PLoS ONE ng mga babaeng dagang C57BL/6 na binigyan ng 200 micrograms ng MP4 sa complete Freund adjuvant, kasama ang pertussis toxin sa araw ng pagpapasimula ng tugon at muli pagkalipas ng 48 oras. Walang hayop na tumanggap ng methylene blue bilang gamot. Pagkatapos ng fixation at pag-embed, kinulayan ng methylene blue ang mga pahalang na hiwa ng spinal cord na isang micrometer ang kapal para sa light microscopy, at ginamitan ng electron microscopy ang ventrolateral tract para sa mas pinong detalye.

Kumuha ng mga sampol ng tisyu sa tatlong yugto: sa rurok ng talamak na yugto gamit ang 7 daga, tatlong buwan matapos ang pagsisimula gamit ang 5 daga, at anim na buwan matapos ang pagsisimula gamit ang 10 daga. Halos magkakapareho ang karaniwang klinikal na marka sa mga yugtong iyon, malapit sa 1.7 hanggang 1.8 sa iskalang 0 hanggang 5. Iba ang ipinakita ng tisyu. Ang pinsalang limitado sa myelin ay tumaas mula sa humigit-kumulang 569,000 hibla bawat square millimeter sa rurok ng talamak na yugto tungo sa humigit-kumulang 1,496,000 sa ikaanim na buwan, at makabuluhan sa estadistika ang paghahambing ng talamak at pangmatagalang yugto sa P na katumbas ng 0.027. Halos dumoble pagsapit ng ikaanim na buwan ang pinagsamang pinsala sa myelin at axon. Nanatiling mas mababa sa isang porsiyento sa bawat yugto ang mga hiblang muling nababalutan ng myelin, isang detalyeng nagpapahinahon sa mga pag-asang maayos ang pinsala.

Sumunod sa hugis U ang pinsala sa axon: mataas sa rurok ng talamak na yugto, mas mababa sa ikatlong buwan, at pinakamataas sa ikaanim na buwan. May kaugnayan ito sa pamamaga ng mitochondria at sa pagliit ng agwat sa pagitan ng mga neurofilament. Isinagawa ang pagtatasa nang hindi alam ng tagasuri ang marka at yugto, kaya mas matibay ang pagbabasang hindi lubos na naipakita ng mga klinikal na marka ang patuloy na pinsala sa estruktura.

Ang hindi pagtutugmang iyon ang tunay na ambag ng pag-aaral sa isang mambabasa tungkol sa MS. Hindi nangangahulugang matatag ang kondisyon ng tisyu kapag matatag ang marka ng kapansanan. Ipinapakita rin nito kung bakit hindi maaaring suportahan ng pag-aaral na ito ang anumang pahayag tungkol sa methylene blue bilang paggamot sa MS. Panahon ang sinubok nito, hindi paggamot.

Bakit walang pag-aaral sa dalawa ang nagpapatunay ng pakinabang sa mga pasyente

Isipin ang bawat pag-aaral bilang mahusay na pagsagot sa isang makitid na tanong, ngunit hindi pagsagot sa tanong tungkol sa mga pasyente.

Una, magkaiba ang sanhi. Sadyang pinupukaw ang EAE gamit ang isang tiyak na antigen at adjuvant. Kusang nabubuo ang MS sa tao, na may mas malawak na hanay ng mga tugon ng sistemang panlaban sa sakit na kinabibilangan ng mga T cell, B cell, likas na panlaban sa sakit, at mga glia na naninirahan sa tisyu. Ang sangkap na nagbabago sa tugong nakatuon sa MOG sa isang daga ay hindi kinakailangang magbago sa mas malawak na tugong iyon sa tao.

Ikalawa, magkaiba ang mga nakikitang katangian. Ang panghihinang umaakyat mula sa buntot patungo sa mga paa sa likuran ng daga ay isang madaling sukatin na resulta. Isinisiksik nito ang pagkakaiba-iba ng MS sa tao sa isang bilang tungkol sa pagkilos. Karaniwang nababago ng mga gamot ang panandaliang marka ng EAE nang hindi binabago ang takbo ng sakit sa tao, kaya kasangkapan ang EAE sa paunang pagsusuri at pag-aaral ng mekanismo, hindi isang pinaliit na klinika.

Ikatlo, hindi pa malinaw ang pagkakalantad sa gamot at ang tiyempo. Ang tuloy-tuloy na maagang pagbibigay ng dosis sa isang 30-araw na eksperimento sa daga ay hindi katumbas ng pangmatagalang pag-inom ng gamot ng isang taong mayroon nang sakit, at walang pag-aaral sa dalawa ang sumukat sa antas ng gamot sa sistemang nerbiyos. Kung wala ang ugnayang iyon, walang tulay mula sa konsentrasyon sa isang platong panglaboratoryo o dosis sa isang daga patungo sa pamamaraan ng paggamot sa tao.

Ikaapat, hindi inuulit o pinatutunayan ng dalawang pag-aaral ang isa't isa. Magkaiba ang mga antigen, tanong, at sukatan ng kinalabasan, at sa isang pag-aaral ay wala talagang paggamot. Mali ang pag-uuri kung sabay silang sisipiin bilang dalawang positibong pag-aaral ng paggamot sa MS.

Ano ang ibig sabihin nito para sa mga mambabasang tumitimbang sa ebidensiya

Walang naitatag na protokol ng methylene blue para sa MS sa mga pag-aaral na ito. Sinusuportahan ng pag-aaral ng paggamot ang karagdagang pananaliksik sa AMPK, SIRT1, NF-kB, at balanse ng Th17 at Treg sa MOG EAE. Paalala naman ang pag-aaral ng patolohiya na maaaring lumala ang pinsala sa tisyu habang tila hindi nagbabago ang mga marka, at na ang methylene blue sa seksiyon ng mga pamamaraan ay kung minsan tumutukoy sa garapon ng pangkulay sa halip na sa kabinet ng gamot. Dapat tandaan ng mga mambabasang sumusubaybay sa patuloy na pananaliksik sa multiple sclerosis ang pagkakaiba ng pangkulay at gamot. Ang mga tanong tungkol sa kaligtasan, kabilang ang mga panganib sa dugo at pakikipag-ugnayan sa ibang gamot, ay dapat talakayin sa isang klinisyan kasama ng pangkalahatang datos sa kaligtasan ng methylene blue bago kumilos ang sinuman batay sa mga ulo ng balita tungkol sa laboratoryo.

Kasya sa isang pangungusap ang pinakabuod. Nagbigay ang isang binanggit na pag-aaral ng methylene blue sa mga dagang may MOG EAE at nag-ulat ng mas banayad na sakit kasabay ng paglipat ng tugon ng sistemang panlaban sa sakit tungo sa pagbawas ng pamamaga, samantalang walang ibinigay na gamot ang isa pang binanggit na pag-aaral at ginamit lamang ang methylene blue upang kulayan ang spinal cord habang itinatala ang anim na buwang naiipong pinsala sa myelin at axon, kaya hindi pinatutunayan ng dalawang pag-aaral na nakatutulong ang methylene blue sa MS sa tao.