Kayang lampasan ng methylene blue ang mitochondrial Complex III? Bakit hindi nagtutugma ang mga pag-aaral

Sinuri ng dalawang laboratoryo kung kayang lampasan ng methylene blue ang nakaharang na mitochondrial Complex III. Hindi ang sagot ng isa. Oo ang sagot ng kabila. Pareho silang may datos.

Natuklasan ng unang pag-aaral, sa mitochondria ng utak ng mouse, na hindi ito kaya ng pangkulay. Natuklasan ng ikalawa, sa mitochondria ng utak mula sa tatlong species ng rodent, na bahagya itong kaya. Madalas banggitin kasabay ng mga ito ang ikatlong pag-aaral, sa atay ng mouse, ngunit iba ang sinubok nito. Ilagay ito sa tamang konteksto at mawawala ang kalahati ng kalituhan.

Walang pangkalahatang mekanismong maipapahayag. May tatlong eksperimento na may magkakaibang pangharang, dosis, at sinusukat na resulta. Unahin ang mga kondisyon. Saka susunod ang mga konklusyon.

Ano ang ibig sabihin ng paglampas dito

Pumapasok ang mga electron sa chain sa pamamagitan ng Complex I (mula sa NADH) o Complex II (mula sa succinate), dumaraan sa Complex III patungo sa cytochrome c, at pagkatapos ay sa Complex IV patungo sa oksiheno. Ang gradient na nabubuo sa prosesong ito ang ginagamit ng selula upang gumawa ng ATP.

Ang pahayag na may paglampas ay nangangahulugang kumukuha ang methylene blue ng mga electron bago ang bara at inililipat ang mga ito pagkatapos ng bara. Tumatanggap ng mga electron mula sa NADH o mga naunang bahagi ng chain ang na-oxidize na pangkulay, na nagiging leucomethylene blue, at ipinapasa ng na-reduce na anyo ang mga ito sa cytochrome c o pabalik sa chain. Kung naipapasa ang mga ito pagkatapos ng bara, bahagyang nanunumbalik ang respirasyon at potensiyal ng membrana. Kung sa mismong bara o bago nito naipapasa, walang nanunumbalik.

Isang detalye ng Complex III ang malaking salik sa pagtatalong ito. Gumagamit ang complex ng Q cycle na may dalawang lugar na pinagbibigkisan ng inhibitor. Kumakabit ang antimycin sa Qi site. Kumakabit ang myxothiazol sa Qo site. Ang pag-aaral na gumagamit lamang ng isa sa mga ito ay kalahati lamang ng complex ang nasubok.

Unang pag-aaral: walang paglampas sa mitochondria ng utak ng mouse

Gumamit si Gureev at mga kasamahan ng mitochondria mula sa cortex ng mga C57BL/6 mouse, na inihiwalay gamit ang digitonin at sinuri sa 0.1 mg protein per ml. Saklaw ng mga substrate ang tatlong kondisyon: pyruvate kasama ang malate sa 5 mM bawat isa, succinate sa 10 mM kasama ang glutamate sa 2 mM, at L-proline sa 10 mM. Ang mga pangharang ay rotenone sa 1 micromolar (Complex I) at antimycin sa 1 microgram per ml (Complex III). Ang mga dosis ng pangkulay ay 0.5, 1, at 2 micromolar, na may 1 micromolar bilang pangunahing konsentrasyon. Nasa maikling ulat sa FEBS Letters ang mga pamamaraan at rekord ng pagsukat.

Gumana ang paglampas sa Complex I. Ibinaba ng rotenone ang respirasyong pinasigla ng ADP mula sa humigit-kumulang 121 tungo sa humigit-kumulang 2 nmol per minute per mg, at ibinalik ito ng 1 micromolar na pangkulay sa humigit-kumulang 21. Nanumbalik ang potensiyal ng membrana sa pyruvate kasama ang malate at sa L-proline.

Hindi gumana ang paglampas sa Complex III. Ibinaba ng antimycin ang respirasyon sa humigit-kumulang 16, at itinaas lamang ito ng pangkulay sa humigit-kumulang 20. Hindi nanumbalik ang potensiyal ng membrana sa alinmang substrate, sa mga dosis ng pangkulay hanggang 5 micromolar. Gayundin ang ipinahiwatig ng datos sa peroxide: ang pangkulay lamang ay nagpataas ng paglabas ng peroxide mula sa batayang bilis na malapit sa 76 pmol per minute per mg tungo sa humigit-kumulang 1170, 1460, at 1945 sa tatlong dosis, ngunit pinababa ng antimycin ang signal na dulot ng pangkulay nang humigit-kumulang 25, 88, at 96 percent, ayon sa pagkakasunod. Kung direktang tumutugon sa oksiheno ang na-reduce na pangkulay, hindi dapat mapahina ng pagharang sa Complex III ang signal. Ipinagpalagay ng mga may-akda na nao-oxidize ang na-reduce na pangkulay sa Qo site ng Complex III, bago ang bara ng antimycin. Sa madaling salita, maikling ikot: mula sa mga tagapagbigay papunta sa pangkulay, mula sa pangkulay papunta sa Qo, saka magpapatuloy sa karaniwang ruta. Nalalampasan ang rotenone. Hindi ang antimycin.

Ikalawang pag-aaral: bahagyang paglampas sa tatlong species, sa parehong lugar ng inhibitor

Pinalawak ni Svab at mga kasamahan ang disenyo. Gumamit sila ng mitochondria ng utak mula sa mouse, rat, at guinea pig, na inihiwalay gamit ang Percoll at sinuri sa parehong 0.1 mg per ml, gamit ang pyruvate kasama ang malate o glutamate kasama ang malate sa 5 mM bawat isa. Gumamit sila ng dalawang pangharang sa Complex III: antimycin A sa 0.3 micromolar at myxothiazol sa 1 micromolar. Ang pangkulay ay nasa 2 micromolar sa karamihan ng mga pagsusuri, at 0.5 sa pagsusuri ng cytochrome c. Nasa artikulong malayang mababasa ang lahat ng tatlong species na sinuri gamit ang magkakatugmang protocol.

Bahagyang nalampasan ang parehong bara, sa lahat ng tatlong species. Sa mitochondria ng mouse, pinahina ng antimycin ang respirasyon at itinaas ito ng pangkulay nang humigit-kumulang 60 percent, mula sa humigit-kumulang 37 tungo sa 59 nmol per minute per mg. Pinahina ito ng myxothiazol nang 88 percent, tungo sa humigit-kumulang 4.5, at pinalaki ito ng pangkulay nang limang ulit tungo sa humigit-kumulang 23. Bahagyang naibalik ang polarisasyon ng membrana sa alinmang inhibitor, na sinukat gamit ang dalawang pangkulay (safranin O at ratiometric TMRM) upang maalis ang posibilidad ng mga artepakto sa pagsukat na optikal.

Direkta ring sinubok ng artikulong ito ang pagpapasa ng electron, na hindi kailanman ginawa ng unang pag-aaral. Ang acetylated cytochrome c na idinagdag mula sa labas sa 25 micromolar ay hindi na-reduce ng mitochondria na may enerhiya, mayroon man o walang inhibitor, ngunit ang pagdaragdag ng pangkulay ay nagpasimula ng reduction sa parehong kaso. Sa buffer na walang selula, na-reduce ng NADH kasama ang pangkulay ang cytochrome c sa bilis na proporsiyonal sa NADH. Sa madaling salita, mas mahabang talon: mula sa mga reducing equivalent papunta sa pangkulay, mula sa pangkulay direkta sa cytochrome c, at mula sa Complex IV papunta sa oksiheno. Ganap na nilalaktawan ng rutang iyon ang Complex III, kaya maaaring malampasan ang parehong pangharang.

Sinusuportahan ng dalawang karagdagang pagsukat ang interpretasyong iyon. Bumaba ang fluorescence ng NAD(P)H nang idagdag ang pangkulay sa mitochondria na nilagyan ng myxothiazol, na nangangahulugang dumaloy palabas ang mga reducing equivalent sa bagong ruta. At nasubaybayan ng absorbance ng pangkulay sa 660 nm ang bawat pagdaragdag, habang ipinakita ng mga supernatant matapos ang centrifugation na naiipon ang na-oxidize na pangkulay sa loob ng mitochondria na may enerhiya nang mahigit isang daang ulit, at pagkatapos ay lumalabas kapag bumagsak ang potensiyal. Tugma rin ang balanse ng mga proton: ang paglaktaw sa mga hakbang ng pagbomba ay nag-iiwan ng humigit-kumulang 2 proton sa bawat pares ng electron sa halip na 10, kaya ang mas mabilis na paggamit ng oksiheno na may bahagyang pagbabalik lamang ng polarisasyon ay siyang anyo ng tunay na paglampas, hindi ebidensiya laban dito.

Sa parehong preparasyon, may mga tugong madaling mapagkamalan kapag pahapyaw lamang ang pagbasa. Kapag may inhibitor kasama ang pangkulay, pinababa ng ADP ang respirasyon sa halip na pataasin ito, at pinasigla ito ng pagharang sa transportasyon sa halip na pabagalin, habang nagbago pa rin ang potensiyal ng membrana sa karaniwang mga direksiyon. Nakapanlilinlang ang pagkonsumo ng oksiheno lamang sa sistemang ito.

Ikatlong pag-aaral: ang pag-aaral sa atay na sumubok sa Complex I at II, hindi sa III

Gumamit sina Lee at Boelsterli ng mitochondria ng atay ng mouse at mga hepatocyte na pinalago sa kultura at napinsala ng efavirenz (Complex I, IC50 na malapit sa 30 micromolar) at hydrazine, ang metabolite ng isoniazid (Complex II, IC50 na malapit sa 30 micromolar). Ang pangkulay sa humigit-kumulang 30 micromolar ay nagpanumbalik ng oxidation ng NADH, potensiyal ng membrana, at ATP habang nagpapababa ng mga oxidant at pagkamatay dahil sa nekrosis. Inilalarawan ito ng artikulo sa Redox Biology bilang pagdadala ng pangkulay ng mga electron upang lampasan ang napinsalang Complex I at II.

Ang resultang iyon ay napagkakasunduang konteksto para sa mga naunang bahagi ng chain, at wala itong sinasabi tungkol sa Complex III dahil walang hinarangan doon. Hindi nito mapagtitibay o mapabubulaanan ang alinman sa mga pag-aaral sa utak.

Ang talahanayan ng mga kondisyon

Apat na dahilan kung bakit maaaring parehong tama ang mga pag-aaral sa Complex III para sa kani-kanilang pagsasaayos

1. Hindi pareho ang ginamit na pagharang. Antimycin lamang sa 1 microgram per ml kumpara sa antimycin sa 0.3 micromolar kasama ang hiwalay na pangharang sa Qo site. Nabibigo ang ruta ng pangkulay na nagpapasok sa Qo site sa mismong kalagayan kung saan nagtatagumpay ang rutang direkta sa cytochrome c. Hindi maaaring kumatawan ang isang site sa pareho.

2. Magkaiba ang dosis ng pangkulay at tiyempo. Pangunahing konsentrasyong 1 kumpara sa 2 micromolar, sa isang sangkap na paulit-ulit na dumaraan sa redox cycle at ang pagpasok nito at direktang pag-reduce sa cytochrome c ay nakadepende sa konsentrasyon at oras. Ang maliliit na agwat sa dosis kasama ng magkaibang oras ng pagsukat ay maaaring maglantad ng magkakaibang bahagi ng iisang network.

3. Magkaiba ang mga preparasyon. Ang paghihiwalay gamit ang digitonin kumpara sa paghihiwalay gamit ang Percoll gradient ay pumipili ng magkakapatong ngunit hindi magkaparehong populasyon ng mitochondria. Magkatugma ang konsentrasyon ng protina sa 0.1 mg per ml, kaya naaalis ang salik na iyon, ngunit hindi ang subpopulasyon at integridad. At naalis ang hinalang species ang dahilan: naulit din ng ikalawang grupo ang naobserbahang tugon sa mouse.

4. Itinatakda ng kalagayan ng substrate kung ano ang magagawa ng pangkulay. Tatlong kondisyon ng substrate kumpara sa mga pares na nakaugnay sa NADH. Magkasamang itinatakda ng suplay ng NADH at potensiyal ng membrana kung gaano kabilis nare-reduce ang pangkulay at kung saan ito namamahagi, at nakadepende sa pagpiling iyon ang rutang nangangailangan ng na-reduce na pangkulay sa tabi ng na-oxidize na cytochrome c.

Paano basahin ang susunod na pahayag tungkol sa paglampas

Itanong kung aling complex ang hinarangan, gamit ang aling inhibitor, sa aling site at dosis. Itanong ang konsentrasyon ng pangkulay at kung kailan ginawa ang pagsukat. Itanong ang tisyu, species, paraan ng paghihiwalay, konsentrasyon ng protina, at substrate. At itanong kung nagtutugma ang potensiyal, respirasyon, kalagayang redox, at direktang pagsusuri sa pagpapasa ng electron, dahil higit sa isang beses na nagbigay ng maling pahiwatig dito ang pagkonsumo ng oksiheno lamang.

Nananatiling wasto ang limitadong buod. Napagkakasunduan ang paglampas ng pangkulay sa Complex I. Sa Complex III, walang nakikitang paglampas na nagpapanumbalik ng paggana sa mitochondria ng mouse na may antimycin sa 1 microgram per ml at pangkulay sa 1 micromolar, samantalang nagpapakita ng bahagyang paglampas ang tatlong species na may antimycin sa 0.3 micromolar o myxothiazol sa 1 micromolar at pangkulay sa 2 micromolar, na may direktang paglilipat mula sa pangkulay papunta sa cytochrome c. Maaaring parehong totoo ang mga pahayag na iyon. Anumang mas malawak na konklusyon ay pagpapalagay na lampas sa datos.

Pinananatili ng mga kaugnay na babasahin ang pinagtatalunang pahayag sa loob ng hindi pinagtatalunang kimika: kung paano inililipat ng methylene blue ang mga electron para sa sunod-sunod na pagpapasa, ang mga eksperimento sa paglampas sa Complex I para sa napagkakasunduang kaso sa naunang bahagi ng chain, mga pagsukat ng potensiyal ng membrana at ang mga artepakto nito para sa dahilan kung bakit kailangan ang dalawang pangkulay, at paghawak sa laboratoryo ng mga sangkap na paulit-ulit na dumaraan sa redox cycle para sa mga patibong sa dosis at tiyempo.