Makala
Mikroskopiýa üçin metilen gögüne alternatiwalar: wezipä görä saýlaň
Ýönekeý bakteriýa çyrşagy üçin maksat öýjükleriň şekilini görmek bolsa, kristal wiolet metilen gögüniň ornuny tutup biler. Diri öýjükler üçin has gowy alternatiwa düýbünden boýagsyz faza-kontrast bolup biler. Saýlaw etmeli synyňyza baglydyr.
Iki adamyň şol bir bakteriýa kulturasy bilen işleýändigini göz öňüne getiriň. Olaryň biri taýajyk şekilli öýjükleri tegelek öýjüklerden tapawutlandyrmak isleýär. Beýlekisi bolsa bejerginiň bakteriýalary öldürendigini ýa-da ýokdugyny bilmek isleýär. Birinji adama aýdyň şekil berýän boýag ikinji adama peýdaly jogap bermän biler.
Orun tutujyny saýlamazdan öň şu sözlemi tamamlaň: “Men ___ içinde ___ synlamaly, öýjükler bolsa diri galmaly / diri galmagy hökman däl.” Bu sözlem boýagyň ýerine ýetirmeli wezipesini kesgitleýär.
Nusgadan we soragdan başlaň
Ilki öýjükleriň diri galmalydygyny ýa-da ýokdugyny kesgitläň, soňra synlamaly aýratynlygyňyzy anyklaň:
- Öýjükler diri galmaly: hereket ýa-da şekil üçin boýagsyz faza-kontrasty ýa-da DIC-i göz öňünde tutuň; ýadro DNK-sy üçin fluoresensiýa bilen Hoechst 33342-ni göz öňünde tutuň; membrananyň bitewiligi üçin SYTO 9 bilen propidium iodide ýaly validasiýa edilen barlag usulyny saýlaň.
- Öýjükleriň diri galmagy hökman däl: bakteriýa morfologiýasy üçin kristal-wiolet bilen ýönekeý boýamany ýa-da nigrozin bilen negatiw boýamany göz öňünde tutuň; Gram reaksiýasy üçin doly Gram-boýama usulyny ulanyň; fiksirlenen öýjüklerdäki ýadro DNK-sy üçin DAPI fluoresensiýasyny göz öňünde tutuň. Her şahanyň çäklendirmelerini deňeşdirmek üçin şu tablisany ulanyň. Bular usul saýlawlarydyr, bar bolan protokolyň içinde çüýşeleri çalyşmak boýunça görkezmeler däl.
| Näme synlamaly | Nusga we enjam | Mümkin alternatiwa | Esasy çäklendirme |
|---|---|---|---|
| Bakteriýalaryň şekili we ýerleşişi | Taýýarlanan bakteriýa çyrşagy; ýagty meýdan | Kristal wiolet bilen ýönekeý boýama | Morfologiýany görkezýär; Gram reaksiýasyny ýa-da ýaşaýyş ukybyny kesgitlemeýär. |
| Gara fonda öýjükleriň daşky çäkleri | Bakteriologik preparat; ýagty meýdan | Nigrozin bilen negatiw boýama | Taýýarlama we formulasiýa möhümdir; boýalmadyk öýjük hökman diri diýmek däl. |
| Gram reaksiýasy | Taýýarlanan bakteriýa çyrşagy; ýagty meýdan | Doly Gram-boýama usuly | Reagentleriň doly yzygiderliligini we gözegçilikleri talap edýär. |
| Diri öýjüklerdäki hereket ýa-da üýtgeşmeler | Gabat gelýän çyg preparat; faza-kontrast ýa-da DIC | Boýag ýok | Degişli optikany talap edýär; kontrast molekulany kesgitlemeýär. |
| Ýadro DNK-sy | Fiksirlenen öýjükler; fluoresensiýa | DAPI | Gabat gelýän oýandyryş we emissiya filtrlerini talap edýär. |
| Diri öýjüklerdäki ýadro DNK-sy | Diri öýjükler; fluoresensiýa | Hoechst 33342 | Öýjüge girmegi şekillendiriş şertleriniň zyýansyzdygyny subut etmeýär. |
| Bakteriýa membranasynyň bitewiligi | Fiksirlenmedik bakteriýalar; fluoresensiýa | SYTO 9 bilen propidium iodide | Membrana boýalyşy ýaşaýyş ukybynyň gytaklaýyn ölçegidir. |
Ýönekeý çyrşak üçin usuly seresaplylyk bilen çalşyň
Wezipe bakteriýa morfologiýasyny bir reňkde görmek bolsa, kristal wiolet amaly kandidatdyr. FDA-nyň Bakteriologik Analitiki Gollanmasynda ýönekeý boýama üçin laýyk iki kristal-wiolet formulasiýasy görkezilýär. Resminamalaşdyrylan formulasiýany we onuň taýýarlanyş usulyny ulanyň; diňe boýagyň ady işleýän reagenti doly kesgitlemeýär.
Kristal wiolet Gram boýamasynda hem ulanylýar, ýöne bu kristal-wiolet bilen ýönekeý boýamany Gram boýamasyna öwürmeýär. ASM Gram-boýama protokolynda tapawutlandyryjy netije kristal wioletiň, ýoduň, reňksizlendirmegiň we garşylyklaýyn boýamanyň yzygiderli täsirine baglydyr. Şol ädimleriň aýrylmagy şekiliň nämäni subut edip biljekdigini üýtgedýär. Bu tapawut üçin ýönekeý boýama bilen Gram boýamasynyň tapawudyna serediň.
Nigrozin daşky çäkleri görkezmegiň başga bir usulyny hödürleýär: ol fonuň reňkini goýaldýar, bakteriýa öýjükleri bolsa deňeşdirilende açyk galýar. Merck-iň nigrozin boýunça görkezmelerinde alternatiwalaryň umumy sanawynda gözden salnyp bilinjek möhüm bir jikme-jiklik bar. Onuň görkezilen iş formulasiýasynda formaldehid bar. Şonuň üçin öýjükleriň özi boýalmadyk görünse-de, diňe “negatiw boýama” diýen sözlerden onuň diri öýjükler bilen gabat gelýändigini netije çykaryp bilmersiňiz. Doly formulasiýany we nusganyň taýýarlanyşyny barlaň.
Diri nusgalar üçin optikany üýtgetmegi göz öňünde tutuň
Öýjükleriň hereketini ýa-da bölünişini synlamak isleýän bolsaňyz, başga bir boýag goşmak synlamany çylşyrymlaşdyryp biler. Nikon-yň şeffaf nusgalardaky kontrast boýunça gollanmasynda düşündirilişi ýaly, faza-kontrast we differensial interferensiýa kontrasty, ýagny DIC, nusgalary olaryň optiki häsiýetlerindäki tapawutlar arkaly görünýän edýär. Mikroskopda zerur komponentler bar bolsa, olar diri, boýalmadyk öýjükleri görkezip biler.
Bu saýlaw boýalmadyk preparaty saklaýar, ýöne elýeterli maglumatlary üýtgedýär. Kontrasty haýsy molekulanyň döredendigini bilmezden araçägi ýa-da hereketi yzarlap bilersiňiz. Sorag molekulanyň ýerleşişi barada bolsa, onuň ýerine degişli bellikleme usulyny saýlaň.
Ýadro DNK-sy üçin Invitrogen-iň DAPI we Hoechst boýaglaryny deňeşdirmesi DAPI-niň köplenç fiksirlenen öýjüklerde ulanylyşyny, öýjüge has aňsat geçýän Hoechst 33342-niň bolsa diri öýjükleri belliklemek üçin ileri tutulýandygyny tapawutlandyrýar. Ikisi hem fluoresensiýa enjamlaryny talap edýär. Olaryň hiç biri reňkli ýagty-meýdan boýagynyň göni ornuny tutmaýar.
Boýaga täsirlenmegi we ýagtylandyrmagy tejribe şertleri hökmünde kabul ediň. Öýjükleriň özüni alyp barşy ölçegiňiz bolsa, boýalan we boýalmadyk preparatlary deňeşdiriň.
Gyzyl öýjük awtomatiki ýagdaýda öli öýjük däldir
SYTO 9 we propidium iodide köplenç bakteriýa membranasynyň bitewiligini bahalandyrmak üçin bilelikde ulanylýar. BacLight gollanmasy bitewi membranalary ýaşyl boýalyş bilen, zeperlenen membranalary bolsa gyzyl boýalyş bilen baglanyşdyrýar. Bu düşündiriş degişli nusga üçin validasiýa edilmelidir.
Rosenberg we kärdeşleriniň 2019-njy ýyldaky barlagy meseläni aýdyň görkezýär. Fosfat-buferli duz erginindäki aýnanyň üstünde ösdürilen 24-sagatlyk E. coli biofilmlerinde öýjükleriň takmynan 96% ýerinde propidium-iodide-pozitiw bolup görünýärdi. Şeýle-de bolsa, awtorlar ýygnalandan soň olaryň 82% ösdürilip bilinýändigini çakladylar. Konfokal şekillerde gyzyl boýalan materialyň aşagynda ýaşyl içki bölekleri bolan öýjükler görünýärdi; bu ýalňyş signala öýjükden daşary nuklein kislotalarynyň goşant goşýandygyny görkezýärdi.
Bu göterimler ähli ýagdaýlar üçin düzediş koeffisiýenti däl-de, barlagdaky preparatlarda geçirilen dürli ölçegleri suratlandyrýar. Peýdaly netije — signalyň nämeden emele gelendigini barlamakdyr. Biofilmde nuklein-kislota boýagy diňe zeperlenen öýjükleriň içindäki materialy däl, öýjükleriň daşyndaky materialy hem ýüze çykaryp biler. Ýaşaýyş ukyby barada netije çykarmak üçin barlagçylar her usulyň öz çäklendirmeleriniň bardygyny belläp, ösdürip ýetişdirmek ýa-da metabolik işjeňlik ýaly goşmaça ölçegleri maslahat berýärler.
Alternatiwanyň hakykatda nämeden durýandygyny barlaň
Alternatiw boýama usuly henizem metilen gögüni öz içine alyp biler. Giemsa muňa mysaldyr: Merck öz önümini, gan we süňk ýiligi çyrşaklaryny hem öz içine alýan ulanyşlar üçin niýetlenen azure-eosin-methylene-blue ergini hökmünde häsiýetlendirýär. Ol başga bir nusga üçin başga bir usul bolup biler, ýöne metilen gögüni doly aýyrmak talabyny kanagatlandyrmaýar.
Bir birleşmäni çykarmak tejribäniň bir bölegi bolsa, şekilleri deňeşdirmezden öň reagentiň şahsyýetini we formulasiýasyny barlaň. Metil gögi, metilen gögi we meňzeş atlandyrylan boýaglar boýunça gollanma atlandyryş tapawutlaryny düşündirýär.
Netijäni ulanmazdan öň çalşygy barlaň
Täze usul üçin degişli nusgalary we laýyk gözegçiligi ulanyp, kiçi göwrümli deňeşdirme geçiriň. Mümkin bolan ýerlerde mikroskop sazlamalaryny deňeşdirip boljak derejede saklaň. Has gowy görünýän şekili diňe saýlamak däl-de, onuň sebäbini derňäp bolmagy üçin reagent formulasiýasyny, nusganyň taýýarlanyşyny, täsirlenme şertlerini we şekillendiriş şertlerini bellige alyň.
Üstünligi başlangyç soraga görä bahalandyryň. Morfologiýa üçin öýjük çäkleriniň we ýerleşişiniň düşündirilip bilinýändigini barlaň. Ýadro belliklemesi üçin signalyň ýerleşişini we fonuny bahalandyryň. Ýaşaýyş ukyby üçin diňe özüne çekiji reňk bölünişiginden has köp subutnama talap ediň. Has giň metilen gögi bilen boýama we laboratoriýa ulanyşlary boýunça gollanma synlamanyň we taýýarlanyşyň biri-birine nähili baglydygyny düşündirýär.
Size gerek ölçegi saklaýan alternatiwany saýlaň. Reňk emele gelen şekiliň diňe bir häsiýetidir.