Metilen gögi we öýjükleriň garramagy: fibroblast barlaglarynyň görkezijileri

Ýygy duş gelýän ýalňyş düşündiriş şeýle bolýar. Bir ylmy makalada metilen gögüniň ösdürilýän fibroblast populýasiýasynyň iki esse artma sanyna 20-den gowrak goşmaça artma goşandygy habar berilýär. Okyjy bolsa munuň garran öýjükleri aýyrýandygyny ýa-da adamyň ömrüni şoňa meňzeş derejede uzaldýandygyny çaklaýar. Bu netije tebigy ýaly görünýär. Emma ol iki aýratyn jähetden nädogrudyr.

Esasy mesele sanlarda däl-de, düşünjelerde. Populýasiýanyň iki esse artmagy, garrama markerleri we telomer ölçegleri hersi başga soraga jogap berýär. Metilen gögi boýunça fibroblast işlerini tejribe gapdaky bir öýjük görnüşiniň garrama ýagdaýyna geçmeginiň gijikdirilmegi baradaky, mitohondriýa ölçegleri bilen goldanýan barlag hökmünde okamak has ýerliklidir. Bu eýýäm garran öýjükleriň saýlanyp aýrylmagyndan tapawutlanýar, organizmiň garramagyndan bolsa ýene-de tapawutlanýar. Bu tapawudyň has giň konteksti mitohondriýalardaky elektron daşalyşynyň öýjük energiýasyny nähili kesgitleýändiginiň we metilen gögi baradaky barlag netijeleriniň nähili düşündirilmelidiginiň bir bölegidir.

Populýasiýanyň iki esse artma sany ýaşlygy däl-de, ösüş taryhyny hasaba alýar

Esasy netijeleriň köpüsi köpelmek ukyby çäkli bolan, adam düwünçeginiň öýkeninden alnan kadaly fibroblast ştammy — IMR90 öýjüklerinden gelýär. Metilen gögi we IMR90 fibroblastlarynyň replikatiw ömri baradaky irki barlagda öýjük ösdürimleri belli tertip boýunça täze gaplara geçirilipdir we ösdürim bölünmegini bes edýänçä populýasiýanyň jemlenen iki esse artma sany hasaba alnypdyr. Esasan 100 nM töweregindäki nanomolýar derejelerde täsir etmek ösdürimlere bölünmesi durmazdan öň 20-den gowrak goşmaça iki esse artmany toplamaga mümkinçilik beripdir.

Populýasiýanyň iki esse artmagy hasaba alyş birligidir. Ol populýasiýanyň takmynan näçe gezek iki esse artandygyny ýazga alýar. Ol aýratyn öýjügiň garrandygyny, wagtlaýyn dynçlyk ýagdaýyndadygyny, differensirlenendigini ýa-da ölendigini gönüden-göni görkezmeýär. Öýjükler bölünmek ukybyny has uzak saklaýandygy üçin, stres sebäpli ir bölünmegini bes edýän öýjükleriň sany az bolandygy üçin ýa-da şertler köpelýän kiçi populýasiýany saýlaýandygy üçin ösdürimiň iki esse artma sany köpelip biler. Diňe bu san şol ýollary biri-birinden tapawutlandyryp bilmeýär.

Şonuň üçin iki esse artma sanlary markerler bilen bilelikde ulanylýar. San köpelmegiň näçe wagt dowam edendigini görkezýär. Markerler bolsa bölünmegini bes eden ýa-da diri galan öýjükleriň haýsy ýagdaýa geçendigini görkezýär.

Netije görkezijileri boýunça gollanma: her marker nämäni görkezýär

Ösdürimdäki garrama birnäçe garaşsyz ölçegden düzülýän fenotipdir. Ýekeje boýag ýa-da belok muny subut etmeýär.

DNK sinteziniň ýitmegi bilen ösüşiň durmagy. Durnukly durma BrdU ýa-da EdU-nyň goşulmagynyň azalmagy, ýasy morfologiýa we gaýtadan ekilenden soň ösüşiň dikeldilmezligi bilen barlanýar. Bu garrama sebäpli durmany wagtlaýyn dynçlyk ýagdaýyndan tapawutlandyrýar.

Garrama bilen baglanyşykly beta-galaktozidaza. SA-beta-gal pH 6.0 töwereginde lizosomal işjeňligi boýag arkaly görkezýär. Lizosomal massa artanda garran fibroblastlar köplenç oňyn boýalýar. Bu diňe garrama mahsus däldir, şonuň üçin ol köpelme we molekulýar markerler bilen bilelikde düşündirilýär.

p16 we p21 ýollary. p16 CDK4 we CDK6 hem-de RB ýoly arkaly täsir edýär. p21 köplenç p53 arkaly induksiýa edilýär. Olaryň derejesiniň ýokarlanmagy bölünmäniň durandygyny tassyklaýan maglumatdyr, ýöne bu beloklaryň hiç biri diňe garrama mahsus däldir.

Sekretor ýagdaý. Garrama bilen baglanyşykly sekretor fenotip ýa-da SASP sitokinleriň, hemokinleriň, ösüş faktorlarynyň we proteazalaryň bölünip çykarylyşynyň üýtgemegini aňladýar. SASP faktorlarynyň RNK ýa-da belok barlaglary öýjükleriň goňşy öýjüklere nähili signal berýändigini görkezýär. Olar köpelmek ukybyny gönüden-göni ölçemeýär.

Oksidantlar we mitohondriýa görkezijileri. Metilen gögi baradaky makalalar mitohondriýalara degişli ölçegleri hem goşýar: IV kompleksiň mukdary we işjeňligi, kislorodyň sarp edilişi, gemiň sintezi, membrananyň massasy, membrana potensialy, ATP we oksidant signallary. Bular bölünmäniň gijikdirilen durmagy bilen bile ýüze çykýan metabolik ýagdaýy beýan edýär. Olar özbaşdak garramany kesgitlemeýär, ýöne teklip edilýän mehanizmi barlaýar. NAD(P)H metilen gögüni reduksiýa edýär, sitohrom c bolsa ony gaýtadan oksidleýär diýen redoks aýlaw modeli şol bir redoks aýlawyny oksidantlaryň az öndürilmegi bilen baglanyşdyrýan IMR90 barlagynda düşündirilýär. Dozalama we paýlanyş bilen baglanyşykly düşündirişler metilen gögüniň farmakologiýasynda we dokumalaryň oňa sezewar bolmagynda beýan edilýär.

Telomerleriň gysgalma tizligi. Dogry birlik bir wagt nokadyndaky uzynlyk däl-de, birnäçe hepdäniň dowamynda her iki esse artmada ýitirilen esas jübütleriniň sanydyr. Has haýal gysgalma her replikasiýada gysgalmanyň azdygyny aňladýar. Bu uzalmagy aňlatmaýar, şeýle hem stres telomerlerde az üýtgeşme bolup, IMR90 öýjükleriniň bölünmesini duruzyp biler.

Fibroblast barlaglarynyň üç dizaýnynyň deňeşdirilmegi

Bu sahypanyň özboluşly materialy aşakdaky deňeşdirmedir. Ol öýjük görnüşini, täsire sezewar bolmagy, ölçegi we çäklendirmäni bir ýerde görkezýär.

Barlag	Öýjükler we täsire sezewar bolma	Näme ölçeldi	Nämäni görkezip bilmeýär
Atamna we beýlekiler, FASEB J 2008	Kadaly IMR90 fibroblastlary, nanomolýar metilen gögüniň dowamly täsiri, standart şert hökmünde 100 nM	Jemlenen iki esse artma sany, IV kompleksiň mukdary, kislorod sarp edilişiniň 37-den 70 göterime çenli artmagy, gemiň sintezi, wodorod peroksidi ýa-da kadmiý sebäpli ýüze çykan wagtyndan öň garramanyň öňüniň alynmagy, HepG2 öýjüklerinde 2-nji faza fermentleri	Garran öýjükleriň aýrylmagy barlanmady. Haýwanlaryň ýa-da adamlaryň uzak ömürliligine degişli netije görkezijisi ýok. Bu ýerde replikatiw ömür tejribe gapdaky iki esse artmalary aňladýar.
Atamna we beýlekiler, Redox Biology 2015, AMPK we IV kompleksiň biogenezi baradaky mehanistik dowam barlagynda beýan edilýär	IMR90 fibroblastlary, esasan 100 nM metilen gögi, deňeşdirme üçin dowamly AMPK işjeňleşdirijisi hökmünde AICAR	NAD-yň NADH-a gatnaşygynyň wagt boýunça üýtgemegi, AMPK-nyň wagtlaýyn fosforlanmagy, PGC-1alpha we SURF1 induksiýasy, IV kompleksiň işjeňliginiň 100 göterimden gowrak artmagy, oksidantlaryň 28 göterim azalmagy, telomerleriň has haýal gysgalmagy, AICAR bilen takmynan 2 goşmaça iki esse artma bilen deňeşdirilende takmynan 18 goşmaça iki esse artma, öýjük sikline täsiriň bolmazlygy	AICAR bilen deňeşdirme doza boýunça takmynan 1000 esse we spesifikligi boýunça tapawutlanýar, şonuň üçin ol deňeşdirilen täsir güýjüni däl-de, işjeňleşme nusgasyny barlaýar. Telomer netijesi birnäçe hepdäniň dowamynda bölünýän ösdürimlere degişlidir.
Xiong we beýlekiler, Aging Cell 2016, progeriýa fibroblastlarynda mitohondriýa we ýadro görkezijileriniň dikeldilmegi baradaky barlagda habar berilýär	Hutchinson-Gilford progeriýasyna degişli ilkinji deri fibroblastlary we olara laýyk kadaly gözegçilik öýjükleri, esasan 5-den 12 hepdä çenli 100 nM	Flýuoressensiýa we elektron mikroskopiýasy arkaly mitohondriýalaryň şekili, janly şekillendiriş arkaly hereketliligi, superoksid, membrana potensialy, ATP, PGC-1alpha, köpelme we garrama markerleri, şeýle hem ýadro membranasynyň gübermegi, progeriniň ýerleşişi, geterohromatin we gen ekspressiýasy	Kadaly garrama däl-de, belli bir kesele mahsus wagtyndan öň garrama modeli. Morfologiýanyň we markerleriň dikeldilmegi garran öýjükleriň aýrylmagy däldir. Haýwanlarda netijelilik ýa-da kliniki netije görkezijisi ýok.
Xue we beýlekiler, Cells 2021 syny, metilen gögüne garramaga garşy kandidat birleşme hökmünde seredýän syn makalasynda jemlenýär	Beýniniň garramagy, neýrodegenerasiýa, deri, ýaralaryň bitmegi we progeriýa baradaky edebiýatlaryň sintezi	Metilen gögüni I we III kompleksler arkaly elektron akymynyň käbir böleklerini aýlanyp geçip bilýän katalitik redoks aýlawçy hökmünde, garramanyň erkin radikal nazaryýetleriniň çäginde düşündirýär	Diňe beýan ediji sintez. Ol gipotezalary tertipleşdirýär we kliniki subutnamalaryň henizem anyk netije bermedik ýerlerini belleýär.

Setirleriň arasyndaky umumy nusga aýratyn bir setirden has möhümdir. Pes dozaly metilen gögi gaýtalanyp has uzak köpelme döwri, IV kompleksiň has ýokary işjeňligi, has pes oksidant signallary we gowulaşan morfologiýa bilen baglanyşdyrylýar. Dizaýn wagt boýunça yzarlanylýan görnüşde galýar: bölünýän öýjüklerden başlamak, sany artýan wagtynda täsir etmek we bölünmäniň näçe wagt dowam edýändigini hasaba almak. Bu gurluş gijikdirme baradaky netijäni goldap biler. Başga dizaýn bolmasa, ol aýyrmak baradaky netijäni goldap bilmez.

Garramagy gijikdirmek garran öýjükleri aýyrmak däldir

Gijikdirme bölünýän öýjükleriň bölünmesini bes etmezden öň has uzak wagt bölünmegini aňladýar. Köplenç senolitik täsir diýlip atlandyrylýan aýyrmak bolsa eýýäm garran öýjükleriň saýlanyp öldürilmegini ýa-da sanynyň azaldylmagyny, şol bir wagtda köpelýän goňşy öýjükleriň diri galmagyny aňladýar.

Metilen gögi baradaky fibroblast edebiýaty birinji gurluşy barlaýar. Ösdürimler başda köpelýän ýagdaýda bolýar, yzygiderli täze gaplara geçirilýän wagtynda täsire sezewar edilýär we bölünmesini has giç bes edýär. Şonuň üçin SA-beta-gal, p16, p21 we SASP faktorlary ýaly markerler has giç ýüze çykýar ýa-da täze gaba geçirmegiň belli bir tapgyrynda has pes derejede bolýar. Başlangyç yza süýşende şeýle nusga garaşylýar. Bu eýýäm garran haýsydyr bir öýjügiň aýrylandygyny subut etmeýär.

Senolitik täsir baradaky netije başga tejribe gurluşyny talap ederdi: ilki ösdürimi barlag arkaly tassyklanan garrama ýagdaýyna getirmek, soň birleşmäni ulanmak, soňra ýaşamaga ukyplylygy we ölümi gönüden-göni ölçemek arkaly şol garran öýjükleriň köpelýän gözegçilik öýjüklerine garanyňda saýlanyp ýitendigini görkezmek. Diňe markeriň peselmegi ýeterlik däldir, sebäbi öýjükler ýitmezden ekspressiýa üýtgäp biler, galan köpelýän öýjükler bolsa tejribe gapda agdyklyk edip biler. Salgylanylýan dört çeşmäniň hiç biri metilen gögi üçin şeýle saýlama azaltma dizaýnyny ulanmaýar. Şonuň üçin takyk häsiýetlendiriş senolitik täsir däl-de, in vitro garramany gijikdiriji ýa-da garramaga garşy işjeňlik bolup galýar. Bu tapawudyň oksidatiw stres bilen baglanyşykly tarapy öýjükleriň reaktiw kislorod görnüşlerine nähili gözegçilik edýändiginde has giňişleýin düşündirilýär.

Wagtlaýyn signal beriş netijesi bu pikiri has aýdyňlaşdyrýar. 2015-nji ýyldaky IMR90 işinde metilen gögi NAD-yň NADH-a gatnaşygynyň gysga wagtlyk ýokarlanmagyna we AMPK-nyň gysga wagtlyk fosforlanmagyna, soňra bolsa ikisi-de IV kompleksiň biogenezi bilen baglanyşykly bolan PGC-1alpha we SURF1 induksiýasyna getiripdir. AICAR bilen dowamly AMPK işjeňleşdirilmegi goşmaça iki esse artmalaryň sany boýunça has pes netije beripdir.

Replikatiw ömür adamyň uzak ömürliligi däldir

Öýjügiň replikatiw ömri kislorody, iýmit gurşawy we täze gaba geçirme tertibi üýtgewsiz saklanýan gözegçilikli tejribe gapda bölünme durýança iki esse artmalaryň sanyny hasaba alýar. Adamyň uzak ömürliligi onlarça ýyllap dowam edýän ösüşi, immuniteti, damar ulgamyny, kök öýjükleriň mikro-gurşawlaryny, özüni alyp barşy we keselleri öz içine alýar. Bir birleşme birinjini uzaldyp, ikinjä täsir etmän biler we köpüsi şeýle edýär.

Progeriýa fibroblastlarynda progerini emele getirýän anyk LMNA mutasiýasy bar; olarda böleklere bölünen we az hereketli mitohondriýalar, pes ATP, şekili bozulan ýadrolar we geterohromatiniň ýitmegi bolýar. Nanomolýar metilen gögi mitohondriýa görkezijilerini gowulandyrypdyr we progeriniň membranadan boşamagyny hem öz içine almak bilen ýadro görkezijilerini ep-esli dikeldipdir. Bu öýjük derejesindäki täsirli dikeldişdir. Şeýle-de bolsa, ol henizem fibroblast netijesidir we awtorlar haýwanlarda synag geçirmegi geljekki iş hökmünde görkezipdirler. Kesel modeliniň özi progeriýa we wagtyndan öň garrama modellerinde metilen gögi baradaky makalada has giňişleýin ara alnyp maslahatlaşylýar.

Mundan okamak üçin amaly barlag sanawy gelip çykýar.

Täsiriň bölünme durmazdan öň ýa-da durma durnuklaşandan soň başlandygyny soraň. Öň başlanmagy gijikdirmäni goldaýar. Aýrylmagy görkezmek üçin soň başlanmagy we saýlama ölüm maglumatlary gerek.
Gözegçilik toparynyň iki esse artma egrisiniň nähili üýtgändigini soraň. Jemlenen iki esse artma sany bolmasa, marker üýtgemeleriniň daýanjy bolmaýar.
Diňe bir boýagyň ýerine, azyndan iki marker synpyny, meselem, köpelmäniň bellenişini, üstesine p16 ýa-da p21-i we SA-beta-gal-y soraň.
Telomerleriň nähili görkezilendigini soraň. Wagtyň dowamynda her iki esse artma üçin tizlik many berýär. Uzynlygyň ýekeje wagt nokadyndaky suraty muny bermeýär.
Nämäniň üýtgewsiz saklanandygyny soraň. Täze gaba geçirilende öýjük dykyzlygy, kislorod, iýmit gurşawynyň çalşyrylmagy we metilen gögüniň täze ýa-da köne ätiýaçlyk erginleri fibroblastlaryň bölünmesiniň durmagyna täsir edýär.

Şeýle okalanda, fibroblast edebiýaty metilen gögi üçin yzygiderli, ýöne çäkli bir orny görkezýär: ösdürilýän adam fibroblastlarynda mitohondriýa görkezijilerini gowulandyrmak bilen bir hatarda replikatiw garramany gijikdirýän pes dozaly, redoks taýdan işjeň birleşme. Iň güýçli mehanistik maglumatlar wagtlaýyn energiýa signal berşine we IV kompleksiň biogenezine degişlidir; bu makalalarda bolsa garran öýjükleriň aýrylmagy ýa-da adam ömrüniň uzalmagy görkezilmeýär.