Metilen gögi mitohondrial III kompleksi aýlanyp geçip bilermi? Näme üçin barlaglaryň netijeleri gabat gelmeýär

Iki barlaghana metilen gögüniň böwetlenen mitohondrial III kompleksi aýlanyp geçip biljekdigini barlady. Biri ýok diýip jogap berdi. Beýlekisi hawa diýdi. Ikisiniň hem maglumatlary bardy.

Syçanyň beýnisiniň mitohondriýalarynda geçirilen birinji barlag boýagyň muny edip bilmeýändigini görkezdi. Gemrijileriň üç görnüşiniň beýni mitohondriýalarynda geçirilen ikinji barlag bolsa muny bölekleýin edip bilýändigini görkezdi. Syçanyň bagrynda geçirilen üçünji barlaga köplenç şu mesele bilen bilelikde salgylanylýar, ýöne ol başga zady barlady. Ony degişli çäginde saklasaňyz, düşünişmezligiň ýarysy aýdyňlaşýar.

Ählumumy mehanizm barada netije çykarmaga esas ýok. Dürli böwetleýjiler, dozalar we ölçeg görkezijileri ulanylan üç tejribe bar. Ilki şertleri okaň. Netijeler şondan gelip çykýar.

Bu ýerde aýlanyp geçmek nämäni aňladýar

Elektronlar zynjyra I kompleks arkaly (NADH-dan) ýa-da II kompleks arkaly (suksinatdan) girýär, III kompleksden geçip sitohrom c-ä ýetýär, soňra IV kompleks arkaly kisloroda geçýär. Şu ýolda emele gelýän gradiýenti öýjük ATP öndürmek üçin ulanýar.

Aýlanyp geçmek baradaky tassyklama metilen gögüniň elektronlary böwediň öň ýanyndan alyp, onuň soň ýanyna geçirýändigini aňladýar. Oksidlenen boýag NADH-dan ýa-da zynjyryň başlangyç böleklerinden elektronlary alyp, leýkometilen gögi görnüşine geçýär, reduksiýalaşan görnüş bolsa olary sitohrom c-ä ýa-da gaýtadan zynjyra berýär. Eger elektronlar böwediň soň ýanyna geçirilse, dem alyş we membrana potensialy bölekleýin dikeldilýär. Eger olar böwediň özüne ýa-da onuň öň ýanyna geçirilse, hiç zat dikeldilmeýär.

III kompleksiň bir aýratynlygy bu jedeliň köp bölegini kesgitleýär. Kompleks iki inhibitor baglanyşma ýeri bolan Q siklini amala aşyrýar. Antimisin Qi ýerine baglanyşýar. Miksotiazol Qo ýerine baglanyşýar. Olaryň diňe birini ulanýan barlag kompleksiň diňe ýarysyny barlandyr.

Birinji barlag: syçanyň beýni mitohondriýalarynda aýlanyp geçiş ýok

Gureev we kärdeşleri C57BL/6 syçanlarynyň beýni gabygynyň digitonin bilen izolirlenen mitohondriýalaryny ulandylar; barlagdaky belok konsentrasiýasy 0.1 mg per ml boldy. Substratlar üç şert toparyny öz içine aldy: hersi 5 mM bolan piruwat bilen malat, 2 mM glutamat bilen 10 mM suksinat we 10 mM L-prolin. Böwetleýjiler 1 micromolar rotenon (I kompleks) we 1 microgram per ml antimisin (III kompleks) boldy. Boýagyň dozalary 0.5, 1 we 2 micromolar bolup, esasy konsentrasiýa hökmünde 1 micromolar ulanyldy. Usullar we ýazga alnan egriler FEBS Letters žurnalyndaky makalada berilýär.

I kompleksi aýlanyp geçmek başartdy. Rotenon ADP bilen stimulirlenen dem alşy takmynan 121-den takmynan 2 nmol per minute per mg çenli peseltdi, 1 micromolar boýag bolsa ony takmynan 21-e çenli dikeltdi. Membrana potensialy piruwat bilen malatda hem, L-prolinde hem dikeldildi.

III kompleksi aýlanyp geçmek başartmady. Antimisin dem alşy takmynan 16-a çenli peseltdi, boýag bolsa ony diňe takmynan 20-ä ýetirdi. Boýagyň 5 micromolar çenli dozalarynda hiç bir substratda membrana potensialy dikeldilmedi. Peroksid maglumatlary hem şol netijäni görkezdi: boýagyň özi peroksid bölünip çykmasyny takmynan 76 pmol per minute per mg bolan başlangyç tizlikden üç dozada degişlilikde takmynan 1170, 1460 we 1945-e ýetirdi, emma antimisin boýagyň döreden şol signalyny degişlilikde takmynan 25, 88 we 96 göterim peseltdi. Eger reduksiýalaşan boýag kislorod bilen gönüden-göni reaksiýa girýän bolsa, III kompleksi böwetlemek signaly basmaly däldi. Awtorlar reduksiýalaşan boýagyň antimisin böwediniň öň ýanynda, III kompleksiň Qo ýerinde oksidlenýändigi barada netije çykardylar. Gysga aýlawy söz bilen aýtsak: donorlardan boýaga, boýagdan Qo ýerine, soňra adaty ýol boýunça öňe. Rotenon böwedi aýlanyp geçilýär. Antimisin böwedi bolsa aýlanyp geçilmeýär.

Ikinji barlag: üç görnüşde, iki inhibitor ýerinde hem bölekleýin aýlanyp geçiş

Svab we kärdeşleri tejribäniň gerimini giňeltdiler. Syçanlaryň, alakalaryň we deňiz doňuzjyklarynyň beýni mitohondriýalary Percoll bilen izolirlendi we şol bir 0.1 mg per ml konsentrasiýada, hersi 5 mM bolan piruwat bilen malatda ýa-da glutamat bilen malatda barlandy. Olar III kompleksiň iki böwetleýjisini ulandylar: 0.3 micromolar antimisin A we 1 micromolar miksotiazol. Boýagyň konsentrasiýasy barlaglaryň köpüsinde 2 micromolar, sitohrom c bilen geçirilen işde bolsa 0.5 boldy. Birmeňzeş protokollar bilen barlanan üç görnüşiň ählisi baradaky maglumatlar açyk elýeterli makalada berilýär.

Üç görnüşiň ählisinde hem iki böwet bölekleýin aýlanyp geçildi. Syçanyň mitohondriýalarynda antimisin dem alşy basdy, boýag bolsa ony takmynan 60 göterim ýokarlandyryp, takmynan 37-den 59 nmol per minute per mg çenli ýetirdi. Miksotiazol ony 88 göterim basyp, takmynan 4.5-e çenli peseltdi, boýag bolsa bäş esse ýokarlandyryp, takmynan 23-e ýetirdi. Inhibitorlaryň ikisinde hem membrana potensialy bölekleýin gaýtadan polýarlanyldy; optiki artefaktlary aradan aýyrmak üçin ol iki boýag (safranin O we ratiometrik TMRM) bilen ölçeldi.

Bu makalada elektronlaryň geçirilmegi hem gönüden-göni barlandy; birinji barlagda beýle synag geçirilmedi. Daşardan goşulan 25 micromolar asetilleşdirilen sitohrom c, inhibitorlar bar bolanda-da, ýok bolanda-da, energiýalaşdyrylan mitohondriýalar tarapyndan reduksiýalaşdyrylmady, emma boýagyň goşulmagy iki ýagdaýda hem reduksiýany döretdi. Öýjüksiz buferde NADH bilen boýag sitohrom c-ni NADH mukdaryna proporsional tizlikde reduksiýalaşdyrdy. Has uzak geçişi söz bilen aýtsak: reduksiýalaýjy ekwiwalentlerden boýaga, boýagdan gönüden-göni sitohrom c-ä, IV kompleksden kisloroda. Bu ýol III kompleksi doly sowlup geçýär, şonuň üçin iki böwedi hem aýlanyp geçmek mümkin.

Ýene iki ölçeg görkezijisi bu düşündirişi goldaýar. Miksotiazol bilen işlenen mitohondriýalara boýag goşulanda NAD(P)H fluoresensiýasy peseldi; bu reduksiýalaýjy ekwiwalentleriň täze ýol arkaly sarp edilýändigini aňladýar. Şeýle hem boýagyň 660 nm-däki ýagtylyk siňdirmesi her goşmaça girizmäni yzygiderli görkezdi, sentrifugirlenenden soňky supernatantlar bolsa oksidlenen boýagyň energiýalaşdyrylan mitohondriýalaryň içinde ýüz esseden gowrak toplanýandygyny, soňra potensial ýykylanda ol ýerden çykýandygyny görkezdi. Protonlaryň hasaby hem muňa laýyk gelýär: protonlary geçirýän tapgyrlardan sowlup geçilende, her elektron jübütine 10 ýerine takmynan 2 proton galýar. Şonuň üçin diňe bölekleýin gaýtadan polýarlanma bilen bir wagtda kislorodyň has çalt sarp edilmegi hakyky aýlanyp geçişiň görnüşidir, oňa garşy subutnama däl.

Şol bir taýýarlanan nusgada ýüzleý okalanda ýalňyş düşündirilip bilinjek jogaplar hem ýüze çykdy. Inhibitor bilen boýag bilelikde bolanda ADP dem alşy ýokarlandyrmagyň ýerine peseltdi, daşama böwediniň döredilmegi bolsa ony haýallatmagyň ýerine stimulirledi; şol bir wagtda membrana potensialy adaty ugurlarda üýtgemegini dowam etdirdi. Bu ulgamda diňe kislorodyň sarp edilişine seretmek ýalňyş netijä eltýär.

Üçünji barlag: III däl-de, I we II kompleksleri barlan bagyr barlagy

Lee we Boelsterli efawirenz (I kompleks, IC50 takmynan 30 micromolar) we izoniazidiň metaboliti bolan gidrazin (II kompleks, IC50 takmynan 30 micromolar) bilen zeper ýetirilen syçan bagrynyň mitohondriýalaryny we ösdürilip ýetişdirilen gepatositleri ulandylar. Takmynan 30 micromolar boýag NADH oksidlenmesini, membrana potensialyny we ATP-ni dikeltdi, şol bir wagtda oksidantlary we nekrotik ölümi azaltdy. Redox Biology žurnalyndaky makalada bu boýagyň elektronlary zeper ýeten I we II kompleksleriň daşyndan alyp geçmegi hökmünde modelleşdirilýär.

Bu netije zynjyryň öňki bölegine degişli ykrar edilen maglumatdyr we III kompleks barada hiç zat aýtmaýar, sebäbi şol barlagda ol ýerde hiç zat böwetlenmedi. Ol beýni barlaglarynyň hiç birini tassyklap-da, inkär edip-de bilmez.

Şertleriň matrisasy

III kompleks boýunça iki barlagyň hem öz şertlerinde dogry bolup bilmeginiň dört sebäbi

1. Böwetleýji bilen edilýän täsir birmeňzeş däldi. Diňe 1 microgram per ml antimisin ulanmak bilen 0.3 micromolar antimisin we aýratyn Qo ýeriniň böwetleýjisini ulanmak bir zat däl. Boýagdan Qo ýerine gidýän ýol, sitohrom c-ä gönüden-göni gidýän ýoluň işleýän ýerinde işlemeýär. Bir ýer iki ýeriň ornuny tutup bilmez.

2. Boýagyň dozasy we wagt tertibi tapawutlandy. Esasy konsentrasiýalar 1 we 2 micromolar boldy; redoks aýlawyna gatnaşýan bu maddanyň siňdirilmegi we sitohrom c-ni gönüden-göni reduksiýalaşdyrmagy konsentrasiýa we wagta baglydyr. Dozadaky kiçi tapawutlar bilen ölçeg wagtyndaky tapawutlar bir toruň dürli şahalaryny ýüze çykaryp biler.

3. Nusgalaryň taýýarlanyşy tapawutlandy. Digitonin arkaly izolýasiýa bilen Percoll gradiýenti arkaly izolýasiýa bölekleýin gabat gelýän, ýöne birmeňzeş bolmadyk mitohondrial populýasiýalary saýlap alýar. Belok konsentrasiýasy ikisinde hem 0.1 mg per ml boldy, şonuň üçin bu üýtgeýji aradan aýrylýar, emma subpopulýasiýa we bitewilik beýle däl. Görnüşiň sebäp bolmagy baradaky şübhe hem aradan aýryldy: ikinji topar öz fenotipini syçanda hem gaýtalady.

4. Substrat ýagdaýy boýagyň näme edip biljekdigini kesgitleýär. Bir tarapda üç substrat şert topary, beýleki tarapda NADH bilen baglanyşykly jübütler bar. NADH üpjünçiligi we membrana potensialy bilelikde boýagyň nähili çalt reduksiýalaşýandygyny we nirede paýlanýandygyny kesgitleýär. Oksidlenen sitohrom c-niň ýanynda reduksiýalaşan boýagy talap edýän ýol bolsa şol saýlawa baglydyr.

Aýlanyp geçiş baradaky indiki tassyklamany nähili okamaly

Haýsy kompleksiň, haýsy inhibitor bilen, haýsy ýerde we haýsy dozada böwetlenendigini soraň. Boýagyň konsentrasiýasyny we ölçegiň haçan alnandygyny soraň. Dokumany, görnüşi, izolýasiýa usulyny, belok konsentrasiýasyny we substraty soraň. Şeýle hem potensialyň, dem alşyň, redoks ýagdaýynyň we gönüden-göni elektron geçiriş synagynyň netijeleriniň biri-birine laýyk gelýändigini soraň, sebäbi bu ýerde diňe kislorodyň sarp edilişi bir gezekden köp ýalňyş ugra gönükdirdi.

Dar çäkli jemleme güýjünde galýar. Boýagyň I kompleksi aýlanyp geçýändigi barada ylalaşyk bar. III kompleks babatda 1 microgram per ml antimisin we 1 micromolar boýag ulanylan syçan mitohondriýalarynda funksional aýlanyp geçiş görünmeýär. Emma 0.3 micromolar antimisin ýa-da 1 micromolar miksotiazol we 2 micromolar boýag ulanylan üç görnüşde boýagdan sitohrom c-ä gönüden-göni geçiriş bilen bölekleýin aýlanyp geçiş görünýär. Bu sözlemler biri-birine garşy gelmeýär. Ondan has giň islendik netije ekstrapolýasiýadyr.

Degişli okaýyşlar jedelli tassyklamany jedelsiz himiýanyň çäginde saklaýar: elektronlaryň geçirilişi üçin metilen gögüniň elektronlary nähili geçirýändigi, zynjyryň öňki bölegindäki ykrar edilen ýagdaý üçin I kompleksi aýlanyp geçiş tejribeleri, näme üçin iki boýagyň gerek bolandygyny düşündirmek üçin membrana potensialynyň ölçegleri we olaryň artefaktlary, doza we wagt bilen bagly ýalňyşlyklara düşünmek üçin bolsa redoks aýlawyna gatnaşýan maddalar bilen barlaghanada işlemek.