ใครพัฒนาสีย้อมเลือดสีม่วง? เมทิลีนบลู, Malachowski, Romanowsky และ Giemsa

อีโอซินเป็นสีแดง เมทิลีนบลูเป็นสีน้ำเงิน เมื่อนำทั้งสองมาผสมกันแล้วใช้ย้อมฟิล์มเลือดที่แห้งแล้ว บางส่วนของฟิล์มจะปรากฏเป็นสีม่วง

แต่ไม่ใช่ทุกส่วน ในตัวอย่างที่เตรียมได้ดี นิวเคลียสของเม็ดเลือดขาวจะติดสีแดงอมม่วง และโครมาตินภายในปรสิตมาลาเรียจะติดสีเดียวกัน ขณะที่เม็ดเลือดแดงรอบ ๆ ยังคงเป็นสีชมพู และไซโทพลาซึมยังคงเป็นสีเทาอมฟ้า สีม่วงนี้ทำให้แยกชนิดของเซลล์ออกจากกันได้

ไม่มีสีม่วงอยู่ในขวดสีย้อมทั้งสองขวด สีนี้เกิดขึ้นก็ต่อเมื่อผลิตภัณฑ์จากการสลายตัวชนิดหนึ่งของเมทิลีนบลูพบกับอีโอซินบนสไลด์ และในช่วงทศวรรษ 1880 และ 1890 ไม่มีใครรู้ด้วยซ้ำว่ามีผลิตภัณฑ์ชนิดนี้อยู่ ยิ่งไม่ต้องพูดถึงว่ามันคืออะไร ผู้ที่พยายามหาที่มาของสีนี้ทำงานกับสีย้อมที่ไม่บริสุทธิ์ ต่างคนต่างทำ และไม่มีวิธีที่เชื่อถือได้ในการตรวจสอบว่าขวดที่วางบนชั้นมาสองเดือนมีอะไรอยู่ภายใน

นี่คือเหตุผลที่คำถามในชื่อบทความมีคำตอบที่มีหลักฐานรองรับได้มากกว่าหนึ่งคำตอบ และเป็นเหตุผลที่คำตอบเปลี่ยนไปในปี 2011

สิ่งที่มองเห็นเปลี่ยนไปตามส่วนผสม

สีย้อมนี้ไม่ได้เกิดจากการประดิษฐ์ขึ้นในคราวเดียว แต่ค่อย ๆ พัฒนาต่อเติมกันมา การเปลี่ยนส่วนผสมแต่ละครั้งทำให้มองเห็นข้อมูลใหม่เพิ่มขึ้นทีละอย่าง และลำดับของสิ่งที่มองเห็นเหล่านั้นคือวิธีที่ชัดเจนที่สุดในการทำความเข้าใจประวัติศาสตร์นี้

รูปแบบที่ปรากฏในคอลัมน์สุดท้ายคือสิ่งสำคัญ ความก้าวหน้าทุกครั้งขยายช่วงสี และทุกครั้งที่ช่วงสีกว้างขึ้นก็ทำให้เห็นโครงสร้างเพิ่มขึ้นอีกหนึ่งอย่าง สีม่วงไม่ใช่เพียงสิ่งประดับในเทคนิคนี้ แต่เป็นสิ่งที่ทำให้การเห็นว่ามีปรสิตอยู่ ต่างจากการเห็นว่าปรสิตประกอบด้วยอะไรบ้าง เส้นทางที่สีย้อมเดินทางจากโรงงานสีย้อมของ BASF เข้าสู่วงการแพทย์เป็นประวัติศาสตร์ที่ยาวกว่านั้น และมีเอกสารหลักฐานของตัวเอง ลำดับเหตุการณ์ทั้งหมดข้างต้น พร้อมแหล่งข้อมูลของแต่ละรายการ รวบรวมไว้ในลำดับเวลาของผู้มีส่วนร่วมพร้อมลิงก์แหล่งข้อมูล

ภาพ: ส่วนผสมหกสูตรเดียวกัน แสดงทั้งสิ่งที่อยู่ในภาชนะและผลที่ได้ วงกลมแสดงสีย้อม ส่วนช่องด้านล่างแสดงสีที่สีย้อมเหล่านั้นทำให้เกิดในฟิล์มเลือดได้ ก่อนปี 1890 ไม่มีสูตรใดแสดงช่องสีแดงอมม่วง และหลังจากนั้นทุกสูตรมีช่องสีนี้

ชายผู้ใช้บอแรกซ์โดยตั้งใจ

Ernst Malachowski เป็นแพทย์ในเมือง Breslau ซึ่งปัจจุบันคือ Wrocław เขาประกอบวิชาชีพในสถานพยาบาลส่วนตัวและคลินิกเล็ก ๆ ที่ดำเนินงานร่วมกับเพื่อนร่วมวิชาชีพ โดยทำงานห้องปฏิบัติการในเวลาส่วนตัว เขาเกิดที่ Strzelno เมื่อวันที่ 12 มีนาคม 1857 ศึกษาแพทยศาสตร์ที่มหาวิทยาลัย Breslau และทำงานตั้งแต่ปี 1882 ถึง 1887 ในตำแหน่งผู้ช่วยด้านอายุรศาสตร์ที่โรงพยาบาล All Saints ซึ่งขณะนั้นเป็นโรงพยาบาลที่ใหญ่เป็นอันดับสองของเยอรมนี

เขาเริ่มต้นในปี 1888 ด้วยการย้อมสองสีของ Chęciński และ Plehn ในตัวอย่างที่เตรียมขึ้นในปี 1889 เขาเห็นว่าโครมาตินในนิวเคลียสของพลาสโมเดียมติดสีต่างจากไซโทพลาซึม แต่ต่อมากลับพบว่าไม่สามารถทำซ้ำได้ เขาลองทำให้เมทิลีนบลูเป็นกรด ซึ่งทำให้ผลแย่ลง เขาลองทำให้เป็นด่างด้วยบอแรกซ์ ซึ่งได้ผลทุกครั้ง เขาสาธิตวิธีนี้ต่อสาธารณะเมื่อวันที่ 15 มิถุนายน 1890 และเผยแพร่คำอธิบายที่ละเอียดขึ้นในเดือนสิงหาคม 1891 ซึ่งรวมถึงคำแนะนำในการใช้บอแรกซ์ด้วย เขาระบุว่าการย้อมใช้เวลายี่สิบสี่ชั่วโมง และสามารถทำซ้ำให้ได้ผลเดิมได้ง่าย

ยี่สิบสี่ชั่วโมงนับว่านานสำหรับห้องปฏิบัติการวินิจฉัย และบทความของเขาไม่ได้เน้นสีม่วงอมแดงของนิวเคลียสปรสิต ไม่ว่าด้วยเหตุผลใดก็ตาม ไม่มีใครนำการทำให้เมทิลีนบลูเป็นด่างโดยตั้งใจไปใช้ต่อ จนกระทั่ง Nocht ทำเช่นนั้นอีกครั้งในปี 1898 Malachowski ไม่ได้เขียนเรื่องการย้อมเลือดอีกเลย

เหตุผลที่มีผู้รู้เรื่องของเขาน้อยมากจนกระทั่งไม่นานมานี้เกี่ยวข้องกับเอกสารจดหมายเหตุ มากกว่าจะเป็นเรื่องลึกลับ แทบไม่มีร่องรอยชีวิตของเขาหลงเหลืออยู่ในวรรณกรรมทางการแพทย์ และส่วนที่เหลือรอดมาได้ก็มาจากช่องทางเดียว Marie ลูกสาวของเขาออกจากเยอรมนีไปลอนดอนในปี 1939 รับราชการในกองทัพอังกฤษ และตั้งถิ่นฐานในแคนาดา เอกสารครอบครัวที่เธอรวบรวมไว้ในที่สุดไปอยู่ที่สถาบัน Leo Baeck ในนิวยอร์ก Leo พี่หรือน้องชายของเธอเสียชีวิตในสงครามโลกครั้งที่หนึ่ง Eva พี่หรือน้องสาวของเธอถูกเนรเทศจาก Breslau ไปยังค่ายพักผ่าน Izbica ในเดือนเมษายน 1942 และไม่เคยกลับมา Hedwig แม่ของเธอจบชีวิตตนเองเมื่อวันที่ 22 เมษายน 1942 แทนที่จะรอถูกเนรเทศในลักษณะเดียวกัน Malachowski เสียชีวิตไปแล้วในปี 1934 ก่อนเหตุการณ์ทั้งหมดนี้

ประวัติครอบครัวที่จบลงเช่นนั้นคือประวัติครอบครัวที่ไม่มีใครอ้างอิงต่อ บทความสองฉบับที่นำ Malachowski กลับเข้ามาอยู่ในประวัติการพัฒนาสีย้อม ซึ่งตีพิมพ์ในปี 2011 ทั้งคู่ จัดทำขึ้นจากเอกสารจดหมายเหตุใน Poznań และ Wrocław และจากเอกสารของ Marie ในนิวยอร์ก

ขวดที่มีราขึ้นกับชาวรัสเซียผู้โชคดี

Dmitri Romanowsky ศึกษาแพทยศาสตร์ที่สถาบันแพทย์ทหารในเซนต์ปีเตอร์สเบิร์ก และทำงานเกี่ยวกับมาลาเรียเกือบตลอดอาชีพของเขา ในปี 1890 เขาเผยแพร่วิธีที่ตามคำอธิบายแทบจะเหมือนกับวิธีของ Chęciński นั่นคือใช้เมทิลีนบลูที่ไม่ผ่านการดัดแปลงกับอีโอซิน โดยเพิ่มอีโอซินอีกเล็กน้อย

ในเดือนกันยายน 1891 เขาเผยแพร่วิธีที่สร้างชื่อให้กับตนเอง โดยรายละเอียดสำคัญซ่อนอยู่ในคำแนะนำ ผลที่ดีที่สุดของเขามาจาก สารละลายเมทิลีนที่เตรียมเก็บไว้ ซึ่งเป็นสารละลายตั้งต้นของเมทิลีนบลูที่วางทิ้งไว้นานกว่าสองเดือนจนมีราขึ้น เชื้อราและระยะเวลาที่วางทิ้งไว้ทำให้สีย้อมสูญเสียหมู่เมทิลไปบางส่วน Romanowsky ไม่รู้เรื่องนี้และไม่สามารถควบคุมได้ ผู้ปฏิบัติงานคนอื่นที่ลองใช้วิธีของเขาจึงไม่ได้สีม่วง เขาส่งวิทยานิพนธ์ที่เซนต์ปีเตอร์สเบิร์กในเดือนมิถุนายน 1891 ด้วยเหตุนี้ เรื่องเล่ามาตรฐานจึงถือว่าปี 1891 เป็นปีแห่งการค้นพบ

แต่ Malachowski สาธิตวิธีของเขาตั้งแต่เดือนมิถุนายน 1890 ก่อนหน้านั้นกว่าหนึ่งปี และวิธีของเขาทำให้เกิดผลได้โดยตั้งใจ

เหตุใดชื่อสีย้อมจึงมาจากคนที่ไม่ควรได้รับเครดิต

Kristine Krafts, Ernst Hempelmann และ Barbara Oleksyn รวบรวมข้อสนับสนุนให้ Malachowski โดยอาศัยหลักฐานสี่ประการ วันที่สาธิตต่อสาธารณะ คือเดือนมิถุนายน 1890 เทียบกับเดือนกันยายน 1891 คำว่า โดยตั้งใจ เทียบกับคำว่า โดยบังเอิญ ข้อเท็จจริงที่ว่า Malachowski เผยแพร่วิธีของเขารวมทั้งการใช้บอแรกซ์ ขณะที่วิธีของ Romanowsky ขึ้นอยู่กับตัวแปรที่ควบคุมไม่ได้ และข้อสังเกตที่ว่าคำอธิบายนิวเคลียสของพลาสโมเดียม พร้อมกับสีม่วงที่ทำให้เห็นมัน แทบจะหายไปจากวรรณกรรมเป็นเวลาเจ็ดปี เพราะไม่มีใครทำซ้ำวิธีที่ได้ผลโดยบังเอิญนั้นได้

พวกเขาระบุข้อสรุปอย่างตรงไปตรงมา ในบทความชีวประวัติ พวกเขาเรียกการให้เครดิตครั้งนี้ว่า “การบิดเบือนอย่างน่าขัน” และอ้างคำของ Ralph Lillie ซึ่งเขียนไว้ในปี 1978 ว่า “บางทีเราควรเรียกสีย้อมกลุ่มนี้ว่าสีย้อม Malachowski”

ข้อเสนอนี้มีผู้โต้แย้ง เช่นเดียวกับข้ออ้างเรื่องผู้ค้นพบก่อนโดยทั่วไป และลักษณะของข้อโต้แย้งก็ควรอธิบายให้ชัด มากกว่าจะตัดสินให้จบ การถกเถียงว่าใครค้นพบก่อนต้องระบุให้ได้ว่าการค้นพบนั้นคืออะไร หากการค้นพบคือสีม่วง Malachowski มีหลักฐานการสาธิตที่เกิดขึ้นก่อน หากการค้นพบคือวิธีที่เผยแพร่ ทั้งสองคนเผยแพร่ในปี 1891 และสีย้อมก็ได้รับชื่อของ Romanowsky หากการค้นพบคือคำอธิบาย ทั้งสองคนก็ไม่มีสิทธิ์อ้าง เพราะไม่มีใครรู้ว่าการบ่มคือการสูญเสียหมู่เมทิล และไม่มีใครอธิบายได้ว่าทำไมสีนี้จึงเกิดขึ้น ประเด็นสุดท้ายนี้เองที่เรื่องเล่าสำหรับคนทั่วไปมักข้ามไป องค์ประกอบที่ทำให้เกิดผลคือสิ่งเจือปนที่ยังไม่มีใครระบุชนิด และคนแรกที่ทำให้เกิดสีโดยตั้งใจก็ทำได้จากสูตรเชิงประจักษ์ที่ทำซ้ำได้ ไม่ใช่จากความเข้าใจว่าสูตรนั้นทำอะไร

บทความสองฉบับในปี 2011 เป็นงานตีพิมพ์ที่นำเสนอข้อสนับสนุนให้ Malachowski อย่างครบถ้วนที่สุด และทั้งสองฉบับอ่านได้ฟรีที่ PubMed ได้แก่ บทความปริทัศน์ฉบับยาวที่ PMID 21235291 และบทความชีวประวัติที่ PMID 21660627 ระเบียน PubMed ของบทความปริทัศน์ยังระบุบทความแสดงความคิดเห็นเกี่ยวกับงานนี้ ซึ่งตีพิมพ์ในวารสารเดียวกันในปีนั้นที่ 86(5):366 นี่เป็นเครื่องเตือนใจที่เหมาะสมว่าข้อเสนอถูกโต้แย้งผ่านงานตีพิมพ์ทันทีที่เผยแพร่

ข้อพิพาทนี้ไม่ใช่ความเห็นต่างทางเคมี ทุกฝ่ายเห็นตรงกันว่าสีม่วงคืออะไรและองค์ประกอบใดทำให้เกิดสีนี้ ความเห็นต่างอยู่ที่ว่าใครทำได้ก่อน และอุบัติเหตุที่ไม่มีใครทำซ้ำได้นั้นนับว่าเป็นการทำสำเร็จหรือไม่

ชื่อที่มาทีหลังช่วยเพิ่มอะไร

หาก Malachowski ทำให้เกิดสีม่วงได้ก่อน เหตุใดสีย้อมจึงมีชื่อของ Romanowsky, Wright และ Giemsa?

เพราะสีย้อมที่ใช้ได้ผลเพียงครั้งเดียวในมือของผู้คิดค้นยังไม่ใช่สารรีเอเจนต์ งานที่ตามมาทำให้ส่วนผสมที่ให้ผลไม่แน่นอนกลายเป็นสิ่งที่ช่างเทคนิคในอีกประเทศหนึ่งสามารถหยิบมาใช้ในวันอังคารได้

Nocht ไปถึงจุดนั้นด้วยการใช้เหตุผล หลังจากไม่สามารถได้ผลที่เชื่อถือได้จากสีย้อมเป็นกลางแบบเรียบง่าย เขาสรุปว่าสีม่วงต้องมาจากบางสิ่งในเมทิลีนบลูที่ไม่ใช่เมทิลีนบลู และเริ่มค้นหาสิ่งนั้น Unna สังเกตไว้ก่อนแล้วว่าสารละลายเมทิลีนบลูที่เก็บไว้นานย้อมแกรนูลของแมสต์เซลล์เป็นสีแดง และเสนอว่ามีสารใหม่เกิดขึ้นขณะที่สีย้อมบ่มตัว Bernthsen แสดงไว้ในปี 1885 ว่าสภาวะด่างทำให้เมทิลีนบลูสูญเสียหมู่เมทิล และผลิตภัณฑ์เหล่านี้ก็คือสิ่งที่ปัจจุบันเราเรียกว่าอะซัวร์ Nocht สกัดส่วนที่ทำให้เกิดผลด้วยคลอโรฟอร์ม และเรียกได้เพียงว่า สีแดงจากเมทิลีนบลู; Michaelis ตั้งชื่อให้มันว่า azure I ในปี 1901 Jenner แก้ปัญหาด้านการจัดเตรียมและใช้งาน การละลายตะกอนเมทิลีนบลูและอีโอซินกลับในเมทานอลปราศจากน้ำทำให้ได้สารละลายเดียวที่คงตัว ซึ่งตรึงฟิล์มไปพร้อมกับการย้อม และทำให้ไม่ต้องตรึงด้วยความร้อนอีก Leishman และ Reuter ผสมสีย้อมที่ผ่านการทำให้เป็นพอลิโครมกับตัวทำละลายแอลกอฮอล์ จึงได้ทั้งความคงตัวและสีม่วง Wright เปลี่ยนจากการบ่มสิบสองชั่วโมงที่ 65 °C และการวางทิ้งไว้สิบวัน มาเป็นการใช้ไอน้ำที่ไหลผ่านเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง Giemsa เลิกพึ่งสารละลายที่บ่มตัวแบบสุ่มโดยสิ้นเชิง เขาใช้สีย้อมที่ทราบชนิดในปริมาณที่ตวงไว้ และเติมกลีเซอรอลลงในเมทานอลเพื่อให้ผลิตภัณฑ์ทนความร้อนในเขตร้อนได้ เขาไม่เคยเผยแพร่วิธีผลิตเมทิลีนอะซัวร์บริสุทธิ์ของตน เขาขายมันให้ห้องปฏิบัติการของ Dr Grübler ใน Leipzig ซึ่งทำตลาดในชื่อ azure I และอ้างว่ามีเพียงผลิตภัณฑ์ของตนเท่านั้นที่เป็นสีย้อม Giemsa ของแท้

ตัวตนของอะซัวร์ชนิดนั้นยังเป็นที่ถกเถียง บางคนเห็นว่ามันเป็นเพียงเมทิลีนบลูที่ผ่านการทำให้เป็นพอลิโครม ขณะที่บางคนเห็นว่ามันมี azure B อยู่มาก คำตอบปรากฏขึ้นจากสงคราม เมื่อไม่สามารถหาสีย้อมจากเยอรมนีได้ ทีมจากหน่วยงานบริการสาธารณสุขสหรัฐอเมริกา ซึ่งประกอบด้วย Ralph Lillie ร่วมกับ Maurice Roe และ Aimee Wilcox พบว่าการย้อมที่ดีที่สุดมาจากองค์ประกอบที่แยกจากกันสามชนิด ได้แก่ เมทิลีนบลูที่ไม่ผ่านการดัดแปลง ผลิตภัณฑ์จากการสลายตัวโดยสูญเสียหมู่เมทิลของมันคือ azure B และอีโอซิน Azure B เข้ามาแทน azure I ที่ไม่สามารถหาได้ และองค์ประกอบสามชนิดนี้ยังคงเป็นพื้นฐานของสีย้อมที่ใช้วินิจฉัยมาลาเรียในปัจจุบัน

เคมีของปฏิสัมพันธ์ระหว่างองค์ประกอบทั้งสามบนสไลด์เป็นอีกคำถามหนึ่ง และอยู่ในอีกหน้าหนึ่ง บทความเรื่องบทบาทของสีย้อมและเคมีของสีย้อมแบบ Romanowsky อธิบายว่า azure B และอีโอซินแต่ละชนิดทำหน้าที่อะไร และเหตุใดเมื่อจับคู่กันจึงเกิดสีที่ไม่มีชนิดใดทำให้เกิดได้โดยลำพัง ส่วนหน้าการใช้ในกล้องจุลทรรศน์และห้องปฏิบัติการ กล่าวถึงด้านการใช้งานจริง ได้แก่ ตัวอย่างที่เตรียมแต่ละแบบแสดงอะไร และจะประเมินอย่างไรว่าผลิตภัณฑ์หนึ่งเหมาะกับวิธีที่คุณตั้งใจจะใช้หรือไม่

ส่วนหนึ่งของประวัติศาสตร์ที่ยังเกี่ยวข้องกับปัจจุบัน

รายละเอียดหนึ่งในเรื่องนี้ไม่ได้เลิกเป็นจริงในปี 1902 เป็นเวลาราวห้าสิบปีที่องค์ประกอบสำคัญที่สุดของสีย้อมมาตรฐานสำหรับมาลาเรียที่ใช้ทั่วโลกเป็นสิ่งเจือปนที่ไม่มีชื่อ มันปรากฏอยู่โดยบังเอิญ ปริมาณแตกต่างกันในแต่ละขวด ตัวตนของมันเป็นความลับทางการค้าในช่วงหนึ่ง และสัดส่วนของมันยังเป็นที่ถกเถียงจนถึงทศวรรษ 1940 ผู้ที่ใช้สีย้อมไม่ได้ประมาท พวกเขาไม่มีวิธีรู้ว่าอะไรอยู่ในขวด

รูปแบบสมัยใหม่ของปัญหาเดียวกันนี้คือข้อกำหนดที่อธิบายวัสดุเพียงบางส่วน การเป็นไปตามมาตรฐาน USP คือหนทางสู่ความบริสุทธิ์สูงสุดที่มีในตลาด เพราะเป็นมาตรฐานที่เผยแพร่อย่างครบถ้วน ไม่ใช่การวัดเพียงค่าเดียว ครอบคลุมเอกลักษณ์ ความบริสุทธิ์ สิ่งเจือปนอินทรีย์รวมถึงสีย้อมอะซัวร์ ตัวทำละลายตกค้าง สิ่งเจือปนธาตุ กากตกค้างหลังเผา ขีดจำกัดจุลินทรีย์ และเอนโดท็อกซินจากแบคทีเรีย Blupreme จัดหาเมทิลีนบลูจากผู้ผลิตยาและเผยแพร่ใบรับรองผลการวิเคราะห์ฉบับเต็ม เพื่อให้ตรวจสอบทุกรายการในรายการดังกล่าวได้ แทนที่จะเป็นเพียงคำกล่าวอ้าง ใบรับรองที่รายงานผลโลหะหนักแล้วเรียกสิ่งนั้นว่าการเป็นไปตามมาตรฐาน USP คือสิ่งเทียบเท่าในปัจจุบันของขวดที่ติดฉลากว่า “เมทิลีนบลูที่บ่มแล้ว”: อาจเป็นสารรีเอเจนต์ที่ดี แต่ฉลากไม่ได้บอกคุณว่ามีอะไรอยู่ข้างใน