E. coli บนวุ้น EMB: ภาพลักษณะโคโลนีและการแปลผล

นักศึกษาคนหนึ่งขีดเชื้อที่ไม่ทราบชนิดลงบนวุ้น eosin methylene blue บ่มข้ามคืน แล้วกลับมาพบโคโลนีสีเข้มที่มีประกายสีเขียวบนจานเพาะเลี้ยง ในสมุดบันทึกเขียนว่า “E. coli ยืนยันแล้ว” ข้อความนี้สรุปเกินกว่าที่จานเพาะเลี้ยงจะรองรับได้ สิ่งที่จานแสดงคือฟีโนไทป์ด้านการเจริญและการหมักภายใต้เงื่อนไขเฉพาะ ส่วนการระบุชนิดเป็นอีกข้อสรุปหนึ่งที่ต้องมีหลักฐานแยกต่างหาก

คู่มือนี้มองผลจากวุ้น EMB เป็นงานแปลผล โดยอธิบายหลักการพื้นฐาน พาชมชุดภาพประกอบจานเพาะเลี้ยงพร้อมตัวควบคุม และชี้ให้เห็นกรณีที่ภาพตามตำราอาจทำให้เข้าใจผิด

หลักการเบื้องหลังจานเพาะเลี้ยง

วุ้น EMB เป็นทั้งอาหารเลี้ยงเชื้อแบบเลือกจำเพาะและแบบแยกความแตกต่าง สีย้อม eosin Y และ methylene blue ยับยั้งจุลินทรีย์แกรมบวกหลายชนิด จึงเอื้อต่อการเจริญของจุลินทรีย์แกรมลบ สีย้อมเหล่านี้ยังทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ด้วย เมื่อจุลินทรีย์หมักน้ำตาลที่มีอยู่และสร้างกรดเฉพาะบริเวณได้มากพอ โคโลนีจะรับสีย้อมในปริมาณมากจนเปลี่ยนเป็นสีม่วงเข้มถึงสีน้ำเงินดำ หากสร้างกรดอย่างมาก ผิวโคโลนีอาจมีเงาเหลือบสีเขียวคล้ายโลหะ วิธีปฏิบัติของ ASM สำหรับจานวุ้น eosin methylene blue อธิบายการเลือกจำเพาะและการแยกความแตกต่างที่ทำงานร่วมกันนี้ พร้อมภาพถ่ายอ้างอิงสำหรับการเรียนการสอน

มีรายละเอียดหนึ่งที่สำคัญก่อนอ่านผลใด ๆ คือ ต้องตรวจสอบว่ากำลังใช้สูตรใด สูตรดั้งเดิมของ Holt Harris Teague มีทั้งแลคโตสและซูโครส ส่วน Levine EMB มีเฉพาะแลคโตส จุลินทรีย์ที่หมักซูโครสแต่ไม่หมักแลคโตส เช่น เชื้อแยกหลายสายพันธุ์ของ Serratia marcescens อาจมีลักษณะต่างกันบนอาหารเลี้ยงเชื้อสองสูตรนี้ เอกสารผู้ผลิตสำหรับอาหารเลี้ยงเชื้อ EMB ระบุความแตกต่างของสูตรนี้ไว้อย่างชัดเจน ให้บันทึกผู้ผลิตและสูตรลงในสมุดควบคู่กับผลที่อ่านได้

วุ้น EMB ที่เตรียมแล้วและยังไม่ได้ใส่เชื้อมักมีสีน้ำตาลแดงถึงม่วงอมแดง บางครั้งอาจมีสีเหลือบเขียวหรือตะกอนละเอียด สีพื้นนี้ไม่ใช่การเจริญของเชื้อ ทุกครั้งที่อ่านผลให้เปรียบเทียบกับจานที่ยังไม่ได้ใส่เชื้อหรือสีพื้นฐานที่บันทึกไว้ และอ่านจานเพาะเลี้ยงครั้งแรกหลังบ่มในสภาวะมีออกซิเจนที่ 35 ถึง 37 C ประมาณ 18 ถึง 24 ชั่วโมง เว้นแต่วิธีปฏิบัติในการเรียนการสอนจะกำหนดไว้ต่างออกไป การบ่มนานขึ้นอาจเปลี่ยนลักษณะที่บ่งบอกการหมักได้

วิธีสังเกตจานเพาะเลี้ยง

ใช้แสงสองแบบ ขั้นแรกตรวจจานด้วยแสงสะท้อนหรือแสงเฉียงแล้วเอียงจาน เงาโลหะเป็นเงาเหลือบที่อาจปรากฏหรือหายไปตามมุมมอง จากนั้นตรวจด้วยแสงส่องผ่านเพื่อประเมินสีโคโลนีและบริเวณกึ่งกลางที่มีสีเข้ม ให้พิจารณาจากโคโลนีที่แยกเดี่ยวชัดเจน เพราะความหนาแน่นและโคโลนีข้างเคียงเปลี่ยนการสะสมกรดเฉพาะบริเวณ และอาจทำให้สีจางลงหรือเข้มขึ้นได้ ชุดภาพของ ASM แสดงประเด็นนี้โดยตรงว่า E. coli ในการเพาะเลี้ยงแบบผสมอาจไม่มีเงาตามที่คาด เพราะจุลินทรีย์รอบข้างเปลี่ยนสภาวะกรดในบริเวณนั้น

ให้ใช้ตัวควบคุมเมื่อกิจกรรมทดลองเอื้ออำนวย ชุดที่ใช้กันทั่วไปในการเรียนการสอนประกอบด้วย E. coli ATCC 25922 สำหรับฟีโนไทป์สีน้ำเงินดำและเงาโลหะ จุลินทรีย์ที่ไม่หมักน้ำตาล เช่น Salmonella Typhimurium ATCC 14028 หรือ Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 สำหรับฟีโนไทป์ไร้สี และจุลินทรีย์แกรมบวก เช่น Enterococcus faecalis หรือ Staphylococcus aureus เป็นตัวควบคุมการยับยั้ง ตามที่ระบุในตารางควบคุมคุณภาพมาตรฐานสำหรับอาหารเลี้ยงเชื้อ EMB หากตัวควบคุมบวกไม่มีเงา ให้สงสัยสภาวะการบ่ม ความหนาแน่นของโคโลนี หรือสูตรอาหารเลี้ยงเชื้อก่อนสงสัยเชื้อที่ไม่ทราบชนิด

ชุดภาพประกอบจานเพาะเลี้ยง

ภาพจานด้านล่างเป็นภาพประกอบที่สร้างขึ้น ไม่ใช่ภาพถ่ายของเชื้อที่เพาะเลี้ยงจริง ภาพเหล่านี้แสดงรูปแบบที่ควรมองหา ไม่ใช่เฉดสีที่แน่นอนของสายพันธุ์ใดสายพันธุ์หนึ่ง ให้เปรียบเทียบกับภาพถ่ายอ้างอิงของ ASM และจานเพาะเลี้ยงจริงจากห้องปฏิบัติการเรียนการสอน

จาน 1: Escherichia coli บนวุ้น EMB จุลินทรีย์ที่หมักแลคโตสอย่างมาก

ภาพประกอบจานวุ้น EMB ที่มีโคโลนีสีน้ำเงินดำเข้มพร้อมเงาโลหะสีเขียว

E. coli บนวุ้น EMB มักมีสีม่วงเข้มถึงสีน้ำเงินดำ โดยมักมีบริเวณกึ่งกลางสีเข้มและเงาโลหะสีเขียวจากการสร้างกรดอย่างมาก เงานี้เป็นลักษณะเด่นที่นักศึกษามักมองหา แต่ควรถือเป็นหลักฐานสนับสนุน ไม่ใช่เกณฑ์นิยาม ความเข้มของเงาแตกต่างกันตามสายพันธุ์ เวลาบ่ม ความหนาแน่นของโคโลนี และมุมมอง การไม่มีเงาไม่ได้ตัดความเป็นไปได้ว่าเป็น E. coli และโคโลนีสีเข้มที่ไม่มีเงาอาจบ่งชี้ถึงจุลินทรีย์ที่หมักน้ำตาลชนิดอื่นได้หลายชนิด หากต้องทำการทดสอบต่อ ให้เลือกโคโลนีที่แยกเดี่ยวชัดเจน แทนการอ่านจากบริเวณที่โคโลนีหนาแน่น

จาน 2: Klebsiella pneumoniae บนวุ้น EMB จุลินทรีย์ที่หมักน้ำตาลและมีโคโลนีแบบเมือก

ภาพประกอบจานวุ้น EMB ที่มีโคโลนีขนาดใหญ่สีชมพูม่วงแบบเมือกโดยไม่มีเงาโลหะ

Klebsiella pneumoniae บนวุ้น EMB มักสร้างโคโลนีขนาดใหญ่ มันวาว และเป็นเมือก ในเฉดสีชมพูม่วงถึงน้ำตาลม่วง มักมีบริเวณกึ่งกลางสีเข้ม แต่โดยทั่วไปไม่มีเงาโลหะเด่นชัด จุลินทรีย์ที่หมักน้ำตาลในกลุ่มใกล้เคียง เช่น Enterobacter ก็อาจมีรูปร่างลักษณะคล้ายกัน ลักษณะเมือกและขนาดโคโลนีเป็นส่วนหนึ่งของการอ่านผล โคโลนีสีชมพูที่มีขนาดเล็กและแบนให้ข้อมูลในการแปลผลต่างจากโคโลนีแบบเมือกขนาดใหญ่ที่นูนเป็นโดม เช่นเดียวกับ E. coli จานเพาะเลี้ยงบ่งชี้ฟีโนไทป์การหมัก และการระบุชื่อในระดับชนิดต้องอาศัยการยืนยันทางชีวเคมีตามที่อธิบายด้านล่าง

จาน 3: Salmonella บนวุ้น EMB และจุลินทรีย์อื่นที่ไม่หมักน้ำตาล โคโลนีไร้สี

ภาพประกอบจานวุ้น EMB ที่มีโคโลนีขนาดเล็ก ไร้สี และโปร่งแสง

Salmonella บนวุ้น EMB และจุลินทรีย์ในกลุ่มใกล้เคียงที่ไม่หมักแลคโตส รวมถึง Shigella และเชื้อแยกหลายสายพันธุ์ของ Pseudomonas มักเจริญเป็นโคโลนีไร้สีถึงโปร่งแสงหรือสีอำพันอ่อน บางสูตรและบางสภาวะทำให้มีสีชมพูจาง ๆ ได้ ดังนั้นโคโลนีสีชมพูอ่อนจึงไม่ได้หมายความว่าเป็นจุลินทรีย์ที่หมักน้ำตาลเสมอไป EMB ไม่สามารถแยก Salmonella ออกจาก Shigella หรือจุลินทรีย์อื่นที่ไม่หมักน้ำตาลได้ การแยกความแตกต่างนั้นต้องอาศัยการทดสอบในขั้นต่อไป นอกจากนี้ ยังมีรายงานสายพันธุ์ Salmonella ที่หมักแลคโตสได้และสร้างโคโลนีเงาโลหะคล้าย E. coli ซึ่งเป็นอีกเหตุผลที่จานเพาะเลี้ยงเพียงจานเดียวไม่เพียงพอสำหรับข้อสรุปสุดท้าย

จาน 4: Serratia marcescens และกับดักเรื่องสูตรอาหารเลี้ยงเชื้อ

Serratia marcescens ควรมีหัวข้อแยกต่างหาก เพราะนักศึกษามักคาดว่าจะพบโคโลนีสีแดงแล้วอ่านผลผิด เชื้อแยกจากตัวอย่างทางคลินิกส่วนใหญ่ไม่หมักแลคโตส จึงมักมีสีซีดถึงติดสีเพียงเล็กน้อยบน Levine EMB เนื่องจากเชื้อแยกหลายสายพันธุ์หมักซูโครสได้ สูตรที่มีซูโครสอาจให้ปฏิกิริยาที่มีสีเข้มขึ้นหรือแสดงผลที่สัมพันธ์กับกรดมากขึ้น และไม่ควรคาดว่าจะพบเม็ดสี prodigiosin สีแดงตามแบบฉบับที่ 35 ถึง 37 C ด้วย เพราะการสร้างเม็ดสีไม่สม่ำเสมอที่อุณหภูมิตู้บ่ม เมื่อวิธีปฏิบัติกล่าวถึง Serratia marcescens บนวุ้น EMB ให้ตรวจสอบว่าข้อความนั้นอ้างอิงสูตรใด บทความทบทวนเมแทบอลิซึมของ Serratia สรุปรูปแบบการไม่หมักแลคโตสและการหมักซูโครสที่แปรผัน ซึ่งเป็นสาเหตุของกับดักนี้

จาน 5: ตัวควบคุมและจุลินทรีย์ที่ถูกยับยั้ง

ชุดภาพประกอบจานวุ้น EMB ที่แสดงลักษณะมีเงา แบบเมือก ไร้สี และยังไม่ได้ใส่เชื้อวางเคียงกัน

จุลินทรีย์แกรมบวก เช่น Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus และ Bacillus โดยทั่วไปถูกยับยั้งหรือมีการเจริญลดลงอย่างชัดเจนบนวุ้น EMB แม้การยับยั้งจะไม่สมบูรณ์สำหรับทุกสายพันธุ์ ชุดตัวควบคุมช่วยให้การอ่านผลมีหลักฐานรองรับ ตัวควบคุม E. coli ควรเจริญได้ดี มีสีน้ำเงินดำและมีเงา ตัวควบคุมที่ไม่หมักน้ำตาลควรเจริญเป็นโคโลนีไร้สี และตัวควบคุมการยับยั้งควรเจริญเพียงเล็กน้อยหรือไม่เจริญเลย หากตัวควบคุมการยับยั้งเจริญได้ดี แสดงว่าขั้นตอนการเลือกจำเพาะล้มเหลว และการอ่านผลอื่นทั้งหมดจากอาหารเลี้ยงเชื้อชุดนั้นก็น่าสงสัย วิธีการย้อมสีตอบคำถามคนละเรื่องกับอาหารเลี้ยงเชื้อ สำหรับการย้อมสไลด์ในห้องปฏิบัติการ ดูชุดภาพการย้อมด้วย methylene blue

การเปรียบเทียบภายใต้ข้อจำกัด

สิ่งที่สังเกตได้บนวุ้น EMB	ความหมายที่เป็นไปได้	สิ่งที่ยังสรุปไม่ได้
โคโลนีสีน้ำเงินดำเข้มที่มีเงาสีเขียวเมื่อใช้แสงเฉียง	การหมักอย่างมาก โดย E. coli เป็นตัวเลือกที่นึกถึงเป็นอันดับต้น ๆ	ชนิดของจุลินทรีย์ เพราะจุลินทรีย์อื่นที่หมักอย่างมากก็มีเงาได้
โคโลนีขนาดใหญ่สีชมพูม่วงแบบเมือก ไม่มีเงา	จุลินทรีย์ที่หมักน้ำตาลและมีลักษณะเกี่ยวข้องกับแคปซูล โดย Klebsiella เป็นหนึ่งในตัวเลือก	ยังระบุเฉพาะเจาะจงว่าเป็น Klebsiella pneumoniae ไม่ได้ เพราะ Enterobacter มีลักษณะคล้ายกัน
โคโลนีไร้สีหรือโปร่งแสง	จุลินทรีย์ที่ไม่หมักแลคโตส เช่น Salmonella, Shigella, Pseudomonas	ยังระบุไม่ได้ว่าเป็นชนิดใด การแยก Salmonella กับ Shigella ต้องใช้การทดสอบอื่น
โคโลนีสีซีดในกรณีที่คาดว่าจะเป็นสีแดง	อาจเป็น Serratia บน EMB ที่มีเฉพาะแลคโตสที่ 37 C	ยังสรุปไม่ได้ว่าไม่มี Serratia ให้ตรวจสอบสูตรและอุณหภูมิ
ไม่เจริญหรือมีโคโลนีเล็กมากที่ถูกยับยั้งการเจริญ	อาจเป็นการยับยั้งจุลินทรีย์แกรมบวก	ยังสรุปไม่ได้ว่าปราศจากเชื้อหรือเป็นจุลินทรีย์ชนิดใด บางสายพันธุ์อาจไม่ถูกยับยั้ง

ประโยคสามประโยคสรุปลักษณะที่อาจทำให้เข้าใจผิดได้ สีเข้มไม่ได้เท่ากับ E. coli เพราะ Klebsiella, Enterobacter และจุลินทรีย์ที่หมักน้ำตาลชนิดอื่นก็เกิดบริเวณกึ่งกลางสีเข้มโดยไม่มีเงาได้ สีชมพูไม่ได้เท่ากับ Klebsiella เพราะจุลินทรีย์ที่หมักปานกลางหรือช้า รวมถึงจุลินทรีย์บางชนิดที่โดยทั่วไปจัดว่าไม่หมักน้ำตาล อาจมีสีชมพูหรือม่วงอ่อนได้ การมีเงาไม่ได้ยืนยันว่าเป็น E. coli เพราะจุลินทรีย์อื่นที่หมักอย่างมากก็สร้างเงาได้ วิธีปฏิบัติสำหรับการเรียนการสอนและภาพการเพาะเลี้ยงแบบผสม แสดงตัวอย่างข้อผิดพลาดเหล่านี้แต่ละกรณี

ข้อจำกัดในการยืนยันผล

วุ้น EMB แสดงฟีโนไทป์ ไม่ใช่ชนิดของจุลินทรีย์ จุลินทรีย์ต่างชนิดกันอาจมีลักษณะโคโลนีแบบเดียวกัน และจุลินทรีย์ชนิดเดียวกันอาจมีลักษณะต่างจากภาพในตำราได้ตามสายพันธุ์ อายุ ความหนาแน่น สูตรอาหารเลี้ยงเชื้อ และสภาวะการบ่ม ด้วยเหตุนี้ กระบวนการทำงานทั้งในการเรียนการสอนและทางคลินิกจึงถือว่ารูปร่างลักษณะบน EMB เป็นเพียงข้อมูลสำหรับการระบุเบื้องต้น

ขั้นตอนที่นักศึกษาสามารถอธิบายและมีหลักฐานรองรับได้คือ บรรยายโคโลนีที่แยกเดี่ยว (ขนาด สี บริเวณกึ่งกลาง เงาภายใต้แสงเฉียง และลักษณะเมือก) บันทึกสูตร ระยะเวลาและอุณหภูมิการบ่ม และตัวควบคุม จากนั้นนำโคโลนีที่แยกเดี่ยวชัดเจนไปเพาะเลี้ยงต่อให้บริสุทธิ์ก่อนทำการทดสอบยืนยันใด ๆ การทดสอบต่อที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่ การย้อมแกรมร่วมกับปฏิกิริยา IMViC เพื่อระบุ E. coli และโคลิฟอร์มเบื้องต้น การทดสอบ TSI หรือ KIA และชุดทดสอบทางชีวเคมีที่จำเพาะต่อจุลินทรีย์สำหรับกลุ่มแบคทีเรียลำไส้ พร้อมการตรวจทางซีรัมวิทยา MALDI TOF หรือวิธีระบุชนิดอื่นที่ผ่านการตรวจสอบความใช้ได้ เมื่องานนั้นจำเป็นต้องใช้ สำหรับพื้นฐานเกี่ยวกับบทบาทของ EMB ในกลุ่มอาหารเลี้ยงเชื้อแบคทีเรียลำไส้แบบเลือกจำเพาะและแบบแยกความแตกต่าง ดูบทนำเกี่ยวกับอาหารเลี้ยงเชื้อแบคทีเรียลำไส้และการย้อมแกรมเพื่อทดสอบต่อ ส่วนคำถามที่เกี่ยวข้องว่าการย้อมสไลด์ด้วยสีน้ำเงินพิสูจน์อะไรได้และไม่ได้บ้างนั้น ชุดภาพการย้อมด้วย methylene blue ก็แยกสิ่งที่สังเกตได้ออกจากข้อสรุปตามหลักเดียวกัน

เขียนสิ่งที่สังเกตได้ก่อนข้อสรุป ข้อความว่า “โคโลนีสีน้ำเงินดำเข้มที่มีเงาสีเขียวเปลี่ยนตามมุมมองบน Levine EMB ที่ 24 ชั่วโมง สอดคล้องกับการหมักแลคโตสอย่างมาก” เป็นข้อความที่มีหลักฐานรองรับ ส่วน “E. coli ยืนยันแล้ว” ต้องมีขั้นตอนยืนยันที่จานเพาะเลี้ยงเพียงอย่างเดียวให้ไม่ได้