การทดสอบยีสต์ด้วยเมทิลีนบลู: การนับเซลล์มีชีวิตกับการจับเวลาการหายใจ

มีหลอดสองหลอดวางอยู่บนโต๊ะปฏิบัติการ ทั้งคู่มีสีน้ำเงิน ในการทดสอบหนึ่ง เซลล์สีน้ำเงินที่เห็นใต้กล้องจุลทรรศน์หมายถึงยีสต์ที่ตายแล้ว ส่วนอีกการทดสอบหนึ่ง หลอดที่เปลี่ยนจากสีน้ำเงินเป็นไม่มีสีหมายถึงยีสต์ยังมีชีวิตและกำลังหายใจ สีย้อมเดียวกัน แต่แปลผลตรงกันข้าม หากสับสนระหว่างการทดสอบทั้งสอง ข้อสรุปทั้งหมดก็จะกลับด้าน

ความแตกต่างนี้คือสาระสำคัญของบทความ เมทิลีนบลูเป็นสีย้อมรีดอกซ์: เมื่อถูกออกซิไดซ์จะมีสีน้ำเงิน เมื่อถูกรีดิวซ์จะอยู่ในรูป leucomethylene blue ที่ไม่มีสี การนับความมีชีวิตใช้เคมีนี้เพื่ออ่านภาพเซลล์ผ่านกล้องจุลทรรศน์ในช่วงเวลาสั้น ๆ ส่วนการทดลองการหายใจใช้เคมีเดียวกันกับปฏิกิริยาของตัวอย่างทั้งหลอดโดยจับเวลา แต่ละแบบต้องมีวิธีปฏิบัติ ชุดควบคุม และข้อควรระวังในการตีความของตนเอง

การนับความมีชีวิต: ย้อมช่วงสั้นและอ่านผลทันที

วิธีปฏิบัติแบบโรงเบียร์เป็นรูปแบบที่มีมาตรฐานชัดเจนที่สุด เตรียมเมทิลีนบลู 0.01% w/v ในโซเดียมซิเตรต 2% ผสมกับสารแขวนลอยยีสต์ในอัตรา 1:1 แล้วตรวจส่วนผสมหลังผ่านช่วงเวลาสั้นที่กำหนดไว้แน่นอน ระยะเวลาที่เผยแพร่มีตั้งแต่ 1 ถึง 2 นาทีในคู่มือ Brewing Science Institute ไปจนถึงประมาณ 5 นาทีในวิธีปฏิบัติงานวิจัย โดยวิธีจุลชีววิทยาไวน์ของ OIV กำหนดให้ตรวจภายใน 10 นาที ความเข้มข้นของสีย้อมในส่วนผสมสำหรับนับจะอยู่ใกล้ 0.005% ใส่ตัวอย่างลงในห้องนับเซลล์แบบ improved Neubauer แล้วใช้กำลังขยายประมาณ 400x จำแนกเซลล์สีน้ำเงินเข้มว่าไม่มีชีวิต และเซลล์ที่ไม่ติดสีว่ามีชีวิต วิธีของ OIV จัดเซลล์สีฟ้าอ่อนว่ามีชีวิต ซึ่งเริ่มสะท้อนปัญหาการตัดสินตามผู้ตรวจที่กล่าวถึงด้านล่าง

ความเข้มข้นของเซลล์คำนวณจากเรขาคณิตของห้องนับ เมื่อนับเต็มช่องสี่เหลี่ยมตรงกลางขนาด 1 mm จำนวนเซลล์ต่อ mL เท่ากับ N คูณตัวประกอบการเจือจางคูณ 10^4 โดย N คือจำนวนเซลล์ที่นับได้ในพื้นที่นั้น ตามที่ระบุในวิธีทดสอบยีสต์ของ ASBC ส่วนความมีชีวิตคำนวณได้ง่ายกว่า: จำนวนเซลล์ที่ไม่ติดสีหารด้วยจำนวนเซลล์ทั้งหมด แล้วคูณ 100 ให้นับประมาณ 400 เซลล์เพื่อประมาณความมีชีวิต ตามการศึกษาเปรียบเทียบในโรงเบียร์ของ FEMS และแนวปฏิบัติของ OIV ใช้กฎขอบช่องแบบเดียวอย่างสม่ำเสมอ เช่น นับเซลล์ที่อยู่บนเส้นขอบล่างและซ้าย แต่ไม่นับเซลล์ที่อยู่บนเส้นขอบบนและขวา

ต้องกำหนดกฎการนับหน่อก่อนเริ่มนับ แนวปฏิบัติที่ใช้กันทั่วไปคือนับหน่อเป็นเซลล์แยกเมื่อมีขนาดประมาณครึ่งหนึ่งของเซลล์แม่ และนับรวมกับเซลล์แม่หากเล็กกว่านั้น ไม่ว่าจะเลือกกฎใด ให้ใช้กับทุกช่องและเขียนลงในแบบบันทึก เพื่อให้ผู้ตรวจคนถัดไปทำซ้ำได้เหมือนกัน

แบบบันทึกการนับ (พิมพ์หน้านี้)

แบบบันทึกนี้จัดทำขึ้นโดยเฉพาะสำหรับบทความนี้ คัดลอกลงสมุดบันทึกหรือพิมพ์หนึ่งชุดต่อตัวอย่าง

ความมีชีวิต (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue) โดย unstained คือจำนวนเซลล์ที่ไม่ติดสี และ dark blue คือจำนวนเซลล์สีน้ำเงินเข้ม จำนวนเซลล์ทั้งหมดต่อ mL = N x dilution factor x 10^4 โดย dilution factor คือตัวประกอบการเจือจาง และ N มาจากพื้นที่ห้องนับที่กำหนดไว้ บันทึกช่วงเวลาย้อมไว้ข้างผลลัพธ์ เพราะค่าความมีชีวิตที่ไม่ระบุเวลาไม่สามารถทำซ้ำได้

เหตุใดค่าความมีชีวิตจึงคลาดเคลื่อน

เวลาเป็นปัจจัยรบกวนอันดับแรก และส่งผลได้ทั้งสองทาง เซลล์ที่มีกิจกรรมเมแทบอลิซึมจะรีดิวซ์สีย้อม ดังนั้นการอ่านผลเร็วอาจพบเซลล์มีชีวิตก่อนที่เซลล์จะรีดิวซ์สีย้อมเสร็จ และจำแนกผิดว่าเป็นเซลล์ตาย แต่การสัมผัสสีย้อมเป็นเวลานานก็เป็นพิษในตัวเอง และทำให้เกิดเซลล์สีน้ำเงินที่เสียหายจริง ส่งผลให้การย้อมบ่งชี้การตายที่ไม่ได้มีอยู่ก่อนย้อม ด้วยเหตุนี้ วิธีปฏิบัติสำหรับการสอนในห้องปฏิบัติการจึงกำหนดให้อ่านผลภายใน 5 นาที ตามที่ระบุในวิธีปฏิบัติการสอนเรื่องยีสต์ของ Wisconsin ข้อสรุปที่รัดกุมคือ การอ่านผลเมทิลีนบลูขึ้นอยู่กับเวลา จึงควรกำหนดช่วงเวลาสั้นช่วงเดียวและใช้ให้คงที่กับทุกตัวอย่างในชุดเดียวกัน

ตัวอย่างที่มีความมีชีวิตต่ำมีความเอนเอียงอีกประการหนึ่ง วิธีมาตรฐานเตือนว่าเมทิลีนบลูอาจประเมินความมีชีวิตจริงสูงเกินไปเมื่อค่าต่ำกว่าประมาณ 80% เพราะเซลล์ที่ยังรีดิวซ์สีย้อมได้อาจไม่ได้คงความสามารถในการสืบพันธุ์ไว้ เอกสารด้านการผลิตเบียร์อธิบายความไม่น่าเชื่อถือแบบเดียวกันเมื่อความมีชีวิตลดลงมาก ควรใช้เมทิลีนบลูเป็นวิธีประมาณอย่างรวดเร็ว และยืนยันการตัดสินใจสำคัญเกี่ยวกับตัวอย่างที่มีความมีชีวิตต่ำ เช่น การนำเชื้อกลับไปใช้หมักอีกครั้ง ด้วยการนับโคโลนีบนเพลตหรือสีย้อมที่ให้ข้อมูลเสริม

ผลจากองค์ประกอบของตัวอย่างเป็นปัจจัยที่สาม วิธีของ OIV ใช้ที่ pH ใกล้ 4.6 และเตือนว่าตัวอย่าง pH ต่ำที่มีความสามารถในการบัฟเฟอร์สูงจะทำให้สีย้อมทำงานไม่ถูกต้อง พร้อมทั้งแนะนำไม่ให้ใช้การทดสอบนี้เมื่อมีน้ำตาลเกิน 100 g/L ซึ่งทำให้เซลล์ปรากฏเป็นสีฟ้าอ่อนจนแปลผลผิดได้ การทดลองเปรียบเทียบ pH ของการย้อมพบว่าความไวเปลี่ยนไปอย่างมากตลอดช่วงที่ทดสอบ สอดคล้องกับการศึกษาวิธีเมทิลีนบลูที่ขึ้นอยู่กับ pH เศษวัสดุเป็นกับดักอีกอย่างหนึ่ง: อนุภาคที่ติดสีในน้ำหมักบดที่มีสิ่งเจือปนดูคล้ายเซลล์ตาย และเพิ่มความแปรปรวนระหว่างผู้ตรวจ

ความแปรปรวนดังกล่าวมีการวัดเชิงปริมาณ ไม่ใช่เพียงข้อสังเกต ในการทดลองโรงเบียร์นานหกเดือนที่รายงานในการเปรียบเทียบยีสต์ของ FEMS การวัดเมทิลีนบลูซ้ำสองครั้งมีค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานเฉลี่ย 6.1% เทียบกับ 0.2% สำหรับโฟลว์ไซโตเมทรีที่ใช้ออกโซนอล โดยผู้ตรวจสองคนให้ผลต่างกันได้ถึง 13 จุดเปอร์เซ็นต์ในตัวอย่างเดียวกัน การเปรียบเทียบเชิงปริมาณของวิธีวัดความมีชีวิตปี 2023 พบว่ากล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์และโฟลว์ไซโตเมทรีมีความเที่ยงสูงกว่าอย่างมาก พร้อมแสดงว่าประสิทธิภาพขึ้นอยู่กับชนิดของยีสต์และองค์ประกอบของตัวอย่าง คำอธิบายวิธีดั้งเดิมโดย Painting และ Kirsop (PMID 24430080) ยังคงเป็นแหล่งอ้างอิงหลัก และบททบทวนการทดสอบความมีชีวิตและความแข็งแรงทางเมแทบอลิซึมของยีสต์ (PMID 25154541) ที่ครอบคลุมกว้างกว่าจัดเมทิลีนบลูเป็นการทดสอบเสริมมากกว่าการทดสอบที่ใช้ตัดสินเด็ดขาด ทริแพนบลูไม่ได้เป็นตัวเลือกที่ดีกว่าโดยอัตโนมัติในกรณีนี้: สีย้อมนี้บ่งชี้การสูญเสียความสมบูรณ์ของเยื่อหุ้มเซลล์ ขณะที่เมทิลีนบลูบ่งชี้ทั้งการรับสีย้อมและกิจกรรมการรีดิวซ์ ดังนั้นเซลล์ที่อยู่ภายใต้ความเครียดอาจถูกจำแนกต่างกันเมื่อใช้สีย้อมสองชนิดนี้

การทดลองการหายใจ: จับเวลาจนสีน้ำเงินหายไป

การทดสอบแบบที่สองไม่ใช้กล้องจุลทรรศน์เลย ใส่ยีสต์ กลูโคส และเมทิลีนบลูเจือจางลงในหลอดปิด แล้วจับเวลาว่าสีน้ำเงินใช้เวลานานเท่าใดจึงหายไป ขณะเซลล์ดำเนินเมแทบอลิซึม เซลล์จะสร้างตัวรีดิวซ์ที่เปลี่ยนสีย้อมสีน้ำเงินเป็นรูปไม่มีสี ขณะที่ออกซิเจนละลายจะออกซิไดซ์สีย้อมกลับ เมื่อเซลล์ใช้ออกซิเจนจนลดลง รีดักชันสุทธิจะเป็นฝ่ายเด่นและสีในหลอดจะหายไป จุดยุติจึงสะท้อนสมดุลระหว่างการหายใจ ความเข้มข้นของสีย้อม และปริมาณออกซิเจนที่มีอยู่ และควรรายงานเป็นเวลาการรีดิวซ์หรือการจางสีของเมทิลีนบลู ไม่ใช่อัตราการใช้ออกซิเจนระดับโมเลกุลโดยตรง

ใช้สีย้อมที่เจือจางกว่างานวัดความมีชีวิตมาก เพื่อให้เวลาที่วัดได้อยู่ในช่วงที่สะดวก คู่มือปฏิบัติการภาคบังคับ A level ของ AQA กำหนดมาตรฐานเรื่องนี้ไว้ชัดเจน: กลูโคส 1 g ต่อน้ำ 100 mL ที่อุ่นถึงประมาณ 30 C เติมยีสต์แห้ง 5 g ทันทีก่อนใช้ และใช้สีย้อมพร้อมใช้งานความเข้มข้นใกล้ 0.001% ซึ่งเตรียมโดยเจือจางสารละลายตั้งต้น 1% ปริมาตร 0.1 mL ให้มีปริมาตรรวม 100 mL ผสมสารแขวนลอยยีสต์ในกลูโคส 2 mL กับสีย้อมพร้อมใช้งาน 2 mL รอให้มีอุณหภูมิสมดุลกับอุณหภูมิทดสอบ เขย่าหนึ่งครั้งนาน 10 วินาที เริ่มจับเวลา และห้ามเขย่าอีก การเขย่าทำให้ออกซิเจนกลับเข้าไปและทำให้หลอดกลับเป็นสีน้ำเงิน ซึ่งเป็นผลแทรกซ้อนจากขั้นตอนที่สำคัญที่สุด AQA ระบุว่าโดยปกติส่วนผสมนี้ควรหมดสีภายในประมาณ 5 นาทีที่ 35 C โดยมีค่าเฉลี่ยจากการทดลอง 275 s ที่ 20 C, 128 s ที่ 35 C และ 145 s ที่ 45 C ตัวเลขเหล่านี้เป็นตัวอย่างจากชุดการทดลองหนึ่ง ไม่ใช่เกณฑ์มาตรฐานสากล ความเชื่อมโยงเชิงปริมาณระหว่างอัตราการรีดิวซ์กับยีสต์ที่มีกิจกรรมเมแทบอลิซึมภายใต้สภาวะควบคุมได้รับการสนับสนุนจากการศึกษาการรีดิวซ์โดยเฉพาะ รวมถึงงานที่จัดทำดัชนีไว้เป็น PMID 25773544 และการศึกษากลไกใน Yeast (2014)

ตัวอย่างการเปลี่ยนแปลงตามเวลา (สื่อที่จัดทำขึ้นเฉพาะ)

ตารางด้านล่างเป็นตัวอย่างที่จัดทำขึ้นสำหรับบทความนี้ โดยใช้ชุดการทดลองแบบ AQA ที่อธิบายข้างต้น: ส่วนผสมยีสต์กับกลูโคส 2 mL ร่วมกับสีย้อมพร้อมใช้งาน 2 mL ที่มีความเข้มข้นใกล้ 0.001% เขย่าหนึ่งครั้งนาน 10 วินาที แล้วบ่มโดยไม่รบกวน ข้อมูลเป็นตัวอย่างค่าที่อ่านได้ในรูปแบบที่กลุ่มนักเรียนควรบันทึก โดยกำหนดดัชนีอัตราเป็น 1 หารด้วยเวลาที่สีหายไปในหน่วยวินาที ทดลองกับหลอดแบบเดียวกัน แล้วแทนข้อมูลเหล่านี้ด้วยค่าที่วัดได้จริง

พล็อตดัชนีอัตราเทียบกับอุณหภูมิสำหรับหลอด A, B และ C เส้นโค้งจะสูงขึ้นแล้วราบลงหรือลดลง ซึ่งเป็นรูปแบบที่คาดหมายสำหรับกระบวนการที่ขับเคลื่อนด้วยเอนไซม์ ไม่ใช่เส้นตรง หลอด D, E และ F ไม่ใช่จุดข้อมูลบนเส้นโค้งนั้น แต่เป็นชุดควบคุมที่ทำให้ตีความเส้นโค้งได้

ชุดควบคุมที่ทำให้การทดสอบแต่ละแบบมีความหมาย

การทดลองการหายใจทุกครั้งต้องมีชุดควบคุมสามแบบร่วมด้วย ยีสต์ที่ต้มแล้วหรือทำให้ตายแล้วร่วมกับกลูโคสและสีย้อมควรคงเป็นสีน้ำเงิน เพื่อยืนยันว่ารีดักชันที่รวดเร็วขึ้นอยู่กับเมแทบอลิซึมของเซลล์มีชีวิต ยีสต์มีชีวิตร่วมกับสีย้อมโดยไม่เติมกลูโคสเป็นชุดควบคุมสารตั้งต้น แต่ยังควรคาดว่าจะเกิดการจางสีช้า ๆ เพราะยีสต์ใช้สารสำรองภายในเซลล์ได้ กลูโคสร่วมกับสีย้อมโดยไม่มียีสต์เป็นชุดแบลงก์ทางเคมี ซึ่งจำเป็นเพราะกลูโคสในสภาวะด่างสามารถรีดิวซ์เมทิลีนบลูได้โดยไม่ต้องมีเซลล์ใด ๆ

การนับความมีชีวิตต้องใช้การควบคุมอีกแบบหนึ่ง นั่นคือความคงที่ของขั้นตอน ใช้สารละลายสีย้อมตั้งต้นเดียวกัน อัตราส่วนผสมเดียวกัน ช่วงเวลาย้อมเดียวกัน พื้นที่ห้องนับเดียวกัน กฎการนับหน่อและขอบช่องเดียวกัน และนับโดยไม่ทราบข้อมูลตัวอย่างเมื่อทำได้ เมื่อผู้ตรวจสองคนให้ผลต่างกันสิบจุดเปอร์เซ็นต์ แบบบันทึกมักช่วยเปิดเผยสาเหตุ: เวลาต่างกัน เกณฑ์ตัดสินสีน้ำเงินต่างกัน หรือกฎการนับหน่อต่างกัน เทคนิคการเตรียมและดูเซลล์ที่ย้อมสีเชื่อมโยงกับวิธีการย้อมแบคทีเรียแบบง่าย ส่วนภาพรวมที่กว้างกว่าว่าสีย้อมทำเครื่องหมายอะไรในตัวอย่างชนิดต่าง ๆ อยู่ในแอตลาสการย้อมสีสำหรับกล้องจุลทรรศน์ สำหรับหลักฟิสิกส์เบื้องหลังการอ่านความเข้มของสีน้ำเงินเชิงปริมาณ เอกสารอ้างอิงการดูดกลืนแสงที่ระบุสภาวะไว้จะอธิบายว่าเหตุใดค่าสัมประสิทธิ์แต่ละค่าจึงต้องระบุสภาวะของตัวทำละลาย pH และความเข้มข้นควบคู่กันเสมอ

เลือกการทดสอบให้ตรงกับคำถาม ขณะนี้มีเซลล์ที่ยังมีชีวิตอยู่กี่เซลล์ เป็นคำถามเรื่องการนับ ซึ่งตอบด้วยกล้องจุลทรรศน์และแบบบันทึก เชื้อนี้กำลังหายใจอย่างแข็งขันเพียงใด เป็นคำถามเชิงจลนศาสตร์ ซึ่งตอบด้วยนาฬิกาจับเวลาและหลอดทดลองที่ควบคุมสภาวะ เมทิลีนบลูใช้ได้กับทั้งสองแบบ แต่ไม่ใช่ในหลอดเดียวกัน ณ เวลาเดียวกัน